锌和维生素e对糖尿病大鼠心肌结构变化的影响保护作用

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1、【摘要】目的：探讨锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌结构的影响。方法：按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/L、pH=4.4的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度>16.6mmol/L,饮水量>40ml/d,尿糖强阳性(+++～++++)的大鼠作为糖尿病大鼠。选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,

2、糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn和VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学的实验观察。结果：糖尿病对照组心肌细胞Bcl2表达弱；糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞Bcl2呈弱表达；糖尿病补Zn+VE组心肌细胞Bcl2呈强阳性表达。图像分析结果显示，糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)；糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>005)。结论：Zn和VE联合使用对糖尿病大鼠心肌细胞有保护

3、作用。【关键词】锌；维生素E；糖尿病；心肌；图像分析　　糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但目前认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关。本研究应用光镜观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞的保护作用，旨在探讨两者对糖尿病大鼠氧化应激时心肌结构的影响。　　1材料与方法　　11材料昆明种SD大鼠50只,雄性,

4、体重180～200g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。　　12方法　　121动物模型建立及分组按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/L、pH=4.4的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度>16.6mmol/L,饮水量>40ml/d,尿糖强阳性(+++～++++)的大鼠作为糖尿病大鼠

5、。选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20%,玉米淀粉65%,植物油8%,纤维素1%,混合维生素1%,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献［5］,合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn组给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4·7H2O去离子水;补VE组每天以50mg/kgVE灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4·7H2O去离子水的同时以50mg/kgVE灌胃。实验期间

6、,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。　　122免疫组织化学SP法检测Bcl2相关抗原主要步骤：①组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；②3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③Bcl2采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；④正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤一抗（Bcl2，1:100)37℃孵育1h，PBS洗4×5min；⑥生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑦

7、链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。　　123免疫组织化学结果判断Bcl2以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Bcl2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率（阳性面积率

8、＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积