食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究

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1、食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究摘要目的：探讨P16和P15基因与ESCC发生发展的关系。方法：应用显微切割、PCR、凝胶电泳、AgNO3染色等技术，检测食管鳞癌（ESCC）和高级别不典型增生中P16、P15基因杂合子缺失（LOH），对照正常细胞，分析ESCC和高级别不典型增生组织中LOH的变化，并就LOH率与患者的临床病理参数分别进行单因素分析。结果：ESCC组织中的LOH率为29.7%，高级别不典型增生组织中的LOH率为16.5%。应用SPSS软件对LOH率与患者的性别、组织分化、淋巴结转移进行单因素分析，差异均无显著性（P>0.05）

2、。结论：①从正常鳞状上皮到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。②P15基因可能与食管鳞癌的发生发展相关。③D9S162位点或其附近可能存在与ESCC发展相关的抑癌基因。　　关键词食管鳞状细胞癌；P16；P15；抑癌基因；杂合性丢失　　AbstractObjective：ToinvestigateP16proteinexpression,entofhepatocellularcarcinoma.Methods：P16proteinexpressioninedbyimmuno-histochemistryin26casesofhepatocellul

3、arcarcinoma.Simultaneouslyadjacenttumortissuesaortissues.TheexpressionofP16proteinbeesloayberelatedentandhisto-differentiationofHCC.P16proteinmayserveasanindicatortopredicttheprognosisofpatients.　　Keya;P16gene;Immunohistochemistry　　食管癌分子生物学研究证明EC中存在一些有规律的染色体改变。P16和P15基因定位于9p21，是目前

4、公认的抑癌基因，但其与ESCC发生发展的分子机制尚不十分清楚。我们通过显微切割、PCR、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、AgNO3染色等技术，检测食管高级别不典型增生和鳞癌组织中P16、P15基因上3个微卫星位点的LOH情况，并就LOH率与患者的临床病理参数进行相关分析，探讨ESCC发生发展过程中基因的变化，为ESCC的早期诊断及预防提供一定的依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　45例ESCC标本（均伴有高级别不典型增生及正常组织）均来自山西省肿瘤医院，按照世界卫生组织2003年新标准进行病理分级、分期〔１〕。所有标本术后立即无菌取材，70%酒精固定，石蜡包埋

5、，同时收集病人有关的临床病理资料。　　1.2主要试剂及仪器　　主要试剂购自美国ResearchGeics公司；基因扩增仪：TC-48/H（t）（美国）；高压电泳仪：EC3000-90(美国)。　　1.3制片　　选定具有鳞状细胞癌、高级别不典型增生及正常组织的蜡块，切取5μm厚的切片若干张，取其中1张做HE染色，供判断病变部位和显微切割参照用。其余切片采用改良HE染色：常规脱蜡,去离子水冲洗1次；快速伊红染色,去离子水冲洗2次，浸泡在10%的甘油TE缓冲液中待用。　　1.4显微切割并制备目的DNA　　将改良HE染色的组织切片置于显微镜工作台上，根据HE染色切

6、片所示区域，在低倍显微镜下找到目的细胞区，用一次性的无菌皮试针头在被切割组织周围刻划，将目的细胞与周围组织分离，然后用针尖粘取纯目的细胞组织，分别放入已标记好的盛有1%蛋白酶K消化液的eppendoff管中。37℃恒温消化24h～48h，95℃灭活蛋白酶K10min，离心后取上清制成样本DNA液，4℃保存。　　1.5PCR扩增　　反应体系：10μL（包括ddH2O　5.7μL、10×buffer液1.0μL、dNTP2.5mmoL/L0.8μL、引物20μmoL/L0.2μL、Taq酶5U/μL0.1μL、待扩增样本DNA液2.0μL）；反应条件：95℃变

7、性10min、95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环、72℃延伸10min；取出PCR反应管后立刻放入冰盒中，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取40%聚丙烯酰胺母液15mL，加入尿素48g，5%TBE20mL，加水至100mL；用前取上述液80mL，加入500μL的APS和35μL的TEMED混匀。电泳液为1%TBE缓冲液。60W,1800V电泳1.5h～2.5h。AgNO3染色，室温凉干。　　1.6结果判断　　当正常组织扩增产物为2条分开的主要条带时，说明此位点为杂合性，判为有意义的信息个体。肿瘤条带中的一条信号强度与其正常对

8、照组织相应产物比较，如减弱50%以上或消失，判断为杂合性丢失；与正