龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损的作用

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1、龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损的作用刘爱军朱永红赵钟祥张立群杜标炎邝枣园李彩霞易华【摘要】　　[目的]观察龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损创面的促进作用。[方法]将人成纤维细胞种植入胶原海绵，人角质形成细胞种植在表层，构建组织工程皮肤，并移植入裸鼠皮肤缺损创面;实验动物随机分为4组，选用"活血圣药"龙血竭于移植后2d分别进行创面外敷、单纯口服、创面外敷+口服治疗，并设空白对照组。组织工程皮肤移植后9d取材检测，观察创面局部表皮厚度、真皮层中层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原蛋白的表达及毛细血管增生情况。[结果]龙血竭能促进组织工程皮肤移植后表皮的

2、发育及真皮层中毛细血管的增生,增强Ln、Ⅰ型胶原蛋白的分泌，龙血竭外敷+口服组效果最佳。[结论]龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤创面有促进作用。【关键词】龙血竭/药理学皮肤缺损/中西医结合疗法皮肤移植组织工程皮肤/病理学细胞培养　　大面积的皮肤缺损需要皮肤移植进行修复，皮源不足是最大的问题，许多患者往往因难以实现及时的救护，而导致感染、多器官功能衰竭等严重并发症甚至死亡。组织工程皮肤是利用来源于自体或异体的皮肤细胞，与适宜的真皮支架复合，在体外构建而成的皮肤类似物，将其移植入皮肤缺损创面，修复缺损的皮肤,为解决皮肤移植中的皮源不足问题提供了光明前

3、景。但目前组织工程皮肤移植后存在表皮层薄、血管化进程慢等问题，导致移植成功率低[1]。　　祖国传统医学在治疗皮肤创伤方面有着悠久的历史，"生肌法"是中医药治疗皮肤创伤的一项重要治则，生肌中药通过"收敛止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修复缺损的皮肤。本研究将构建的组织工程皮肤移植后，利用活血圣药龙血竭作用于移植处，观察创面微环境的变化，探讨利用生肌中药促进组织工程皮肤修复创面的可能性，现报道如下。　　1材料与方法　　1.1主要材料高糖?DMEM及低糖?DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灏洋生物制品科技有限公司);25cm2

4、塑料培养瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型胶原酶(均为Sigma公司);其他试剂均为国产分析纯。龙血竭购自广州市杏园春大药房;幼儿包皮取自中山一院儿外科无菌切除标本(病人家属知情);人角质形成细胞购自中山大学北校区实验动物中心;胶原海绵购自广州市创尔生物技术有限公司。　　1.2实验动物SPF级裸鼠，雌雄不拘，体质量约20g，购自本校实验动物中心，合格证号：SCXK粤2003?0001，粤监证字2007A015。　　1.3免疫荧光试剂及仪器Ⅰ抗层粘连蛋白(Ln)(博士得生物试剂公司);Ⅰ型胶原(Sigma公司);Ⅱ抗为红色荧光探针(Cy3

5、)标记的山羊抗小鼠IgG(IgG?Cy3)，核标记物为二脒基苯基吲哚(DAPI)，均购自Sigma公司;IX71奥林巴斯倒置荧光显微镜(日本)。　　1.4实验方法　　1.4.1人皮肤细胞的培养取无菌切除术后幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素2×105U/L、链霉素200mg/L的磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，尽可能剔除皮下组织，剪成约2mm×2mm小块，置于1g/LⅡ型胶原酶消化液中消化过夜(4℃、约18h)，分离表皮和真皮。将真皮剪碎，然后转移至2.5g/L胰蛋白酶中约15min，以含体积分数10%FBS的高糖?DMEM培养液终止消化，1

6、000r/min离心3min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶中，以含体积分数10%FBS的高糖?DMEM培养液分离培养人包皮成纤维细胞。角质形成细胞以含体积分数10%FBS的低糖?DMEM培养液常规培养传代。　　1.4.2组织工程皮肤的构建将无菌的胶原海绵剪成1cm×1cm×0.2cm小块，放入无菌24孔板内，取第3～5代人包皮成纤维细胞，按1×105个/cm2将细胞种植于胶原海绵两面，体积分数5%CO2、37℃静置培养3～4h。将人角质形成细胞以1×105个/cm2密度接种于单面胶原海绵，无菌培养3～4h。　　1.4.3组织工程皮肤的移

7、植SPF级裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg剂量)，固定于手术台上，严格消毒后，沿背部正中线左右距脊柱约0.5cm处皮肤呈"C"形切开，形成皮瓣，分离皮下组织至深筋膜，暴露肌层，切口大小约1cm2。将体外构建的组织工程皮肤覆盖到全层皮肤缺损的创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，单针缝线固定皮瓣于正常皮肤上，无菌纱布包扎。术后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。单笼饲养。　　1.4.4实验分组实验动物随机分为4组，每组4只，分为龙血竭外敷组(隔天换药)、内服(按70mg·kg-1·d-1剂量灌胃)组、外敷+内服组，不用药者为空白对照组。于术

8、后9d取材检测，单笼饲养。　　1.4.5免疫荧光检测术后9d取材，连同周边正常皮肤剪去稍许，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中