汉坦病毒核衣壳蛋白抗原多肽片段的合成与应用论文

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1、汉坦病毒核衣壳蛋白抗原多肽片段的合成与应用论文.freelorrhagicfevere;Hantaan-virus;capsid;epitopemapping;peptidesynthe-sis;enzyme-linkedimmunostorbentassayAbstract:AIMToestablishaneethodtotestHFRS.METHODSEpitope（aa17-66）ofnucleocapsidproteinHFRSpatients，9fromHBVpatientsand11fromh

2、ealthypeopleHBVpatientsandhealthypeopleHFRSpatientsforanti-HVIgGpositiveand21serafromHFRSpatientsforanti-HVIgMpositive.Sensitivityoftheresultsple，fast，highlyspecificandsensitivemethodsuitableforearlydiagnosisofHFRSinfectedpeople.0引言肾综合征出血热（HFRS）为布尼亚病毒科汉坦病

3、毒属病毒（Hantavirus，HV）引起的自然疫源性传染病，我国是HFRS流行的主要国家［1-3］.HV基因组由L，M，S三个片段构成，分别编码病毒RNA聚合酶、囊膜糖蛋白G1和G2及核衣壳蛋白（简称核蛋白，Nucleocapsidprotein，NP）［4，5］.囊膜糖蛋白上具有中和及血凝抗原位点，可诱导中和抗体和保护性细胞免疫反应;核蛋白上虽无中和性抗原位点，但仍可诱导保护性细胞免疫，现有研究表明，在核蛋白上也可能有中和性抗原位点存在［6，7］.血清学研究表明，汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原

4、性，患者对核蛋白的抗体不仅出现早，且滴度高［8］.应用单克隆抗体进行的研究表明，抗NP血清或单抗虽然没有中和活性，但用NP免疫的动物仍可产生一定的抗病毒免疫［9-11］.此外还发现抗NP血清或单抗可与多种血清型病毒抗原产生交叉反应，而NP抗原也可与汉坦病毒属内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应，表明汉坦病毒NP具有共同的抗原决定簇［12，13］.Vapalahti等［9］应用PERSCAN技术，对连续交错合成的覆盖NP全长的141个14肽进了免疫检测，用兔抗汉坦病毒免疫血清检测后发现了6个多肽抗原线性

5、表位，同时用14份急性期和2份恢复期患者血清进行NP表位抗原检测，发现具有共同反应的抗原表位主要集中在NP氨基酸序列的亲水区.Gott和Elgh等［14，15］分别应用重组DNA技术表达NP的部分片段，并进行免疫学测定和动物实验，表明NP的B细胞表位主要位于NP的氨基端，读框内第62-79位氨基酸残基可能对表位的抗原性和免疫原性起到重要作用.白雪帆等［16，17］用多株具有不同反应谱的国产单克隆抗体，对呈现在噬菌体表面的汉坦病毒76-118株随机NP多肽片段进行了免疫筛检，结果表明汉坦病毒N端从读框内启始

6、密码（第一个氨基酸）起至第86位氨基酸的范围内为该病毒的主要的线性表位，这一表位可被我国学者制备的广谱（组特异性）单抗L13F3，B11和型特异性单抗5H5（野鼠型）及R31（家鼠型）所识别.实验还发现，汉坦病毒NP氨基端这一多肽表位的抗原强度与其大小成正比，最小似不能小于52个氨基酸残基，即必须包括NP（aa15-66）这一核心序列，否则抗原性将明显减弱，以至于无法检出.我们根据以上结果，用Antheprot4.3蛋白序列分析软件包，通过计算机对S片段编码蛋白各区域进行亲疏水性、抗原性和二级结构预测.采

7、用固相多肽合成法合成了NP（aa17-66）多肽.发现这个多肽序列抗原性较强，同时建立了以合成肽为抗原的新型特异性检测抗汉坦病毒IgG和IgM的ELISA测定法.1材料和方法1.1材料①肽合成仪及其主要试剂:PioneerPeptideSynthesisSystem（先锋多肽合成仪）、9-芴基甲基氧羰基（Fmoc）-PAL-PEG-PS树脂、Fmoc-L-氨基酸、缩合剂:O-苯并三唑基-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）、脱保护剂:200gL-1哌啶的二甲基甲酰胺溶液、二甲基甲酰胺（DMF）

8、、二异丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（美国PerSeptiveBiosystems公司）;甲醇（HPLC级）（天津四友生物医学技术有限公司产品）;苯甲基硫醚、1，2-巯基乙烷、苯甲基醚（Sigma公司产品）;②血清标本:收集西安地区肾综合征出血热患者血清23份，乙型肝炎患者血清9份，正常人血清11份.③ELISA试剂:采用丹麦产96孔可拆式NuncMaxiSorp聚苯乙烯酶标板，包被抗原用的缓冲液为0.02molL-1pH8.