鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

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微生物学通报Oct.20,2017,44(10):2380−2390MicrobiologyChinahttp://journals.im.ac.cn/wswxtbcntongbao@im.ac.cnDOI:10.13344/j.microbiol.china.170044研究报告鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测1111,21*程俊茗万明月周晋扬贾丹胡鲲(1.上海海洋大学水产与生命学院上海201306)(2.中国水产科学院黄海水产研究所山东青岛266071)摘要：【目的】探明上海某养殖场的异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)发生死亡的病因，研究致病菌分类地位和毒力基因携带情况。【方法】通过病原菌的筛查和回感试验，确定发病原因，对16SrRNA基因、gyrB和rpoB管家基因测序，建立病原菌系统进化树，结合API-32E细菌鉴定系统对菌株的生理生化进行鉴定，综合判定致病菌的种类及其分类地位；根据已报道的7个毒力基因fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB序列，设计引物进行PCR扩增，研究病原菌毒力基因携带情况。【结果】致病菌GY15是导致异育银鲫发病的原因，GY15的16SrRNA、gyrB和rpoB基因与已报道的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)相似性在99%以上，构建系统进化树和API鉴定确定该菌株为E.tarda，腹腔注射回感可导致异育银鲫死亡，5半致死浓度(LD50)为4.26×10CFU/mL；已报道的7种毒力基因在该致病菌中均能被检测到；药敏试验结果显示，该菌对恩诺沙星、氟苯尼考和氧氟沙星等15种药物敏感，对新霉素、四环素和复方新诺明等18种药物表现为耐药。【结论】首次报道E.tarda可感染异育银鲫，它对异育银鲫的养殖造成威胁。关键词：异育银鲫，迟缓爱德华氏菌，鉴定，毒力基因Foundationitem:SpecialFundforAgro-scientificResearchinthePublicInterest(No.201203085);NationalNaturalResourcesPlatformofChina;ShanghaiOceanUniversityKnowledgeServicePlatform*Correspondingauthor:Tel:86-21-61900453;E-mail:khu@shou.edu.cnReceived:January16,2017;Accepted:May04,2017;Publishedonline(www.cnki.net):August08,2017基金项目：公益性行业(农业)科研专项项目(No.201203085)；国家水产种质资源平台项目；上海海洋大学知识服务平台项目*通讯作者：Tel：86-21-61900453；E-mail：khu@shou.edu.cn收稿日期：2017-01-16；接受日期：2017-05-04；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2017-08-08 程俊茗等:鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测2381IdentificationandvirulencegenesdetectionofEdwardsiellatardaisolatedfromCarassiusauratusgibelio1111,21*CHENGJun-MingWANMing-YueZHOUJin-YangJIADanHUKun(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)(2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,Shandong266071,China)Abstract:[Objective]ToconfirmthepathogenythatcausesCarassiusauratusgibeliodeathinsomefishfarmsinShanghai,andcharacterizethevirulencegenesofthepathogenicbacteria.[Methods]Thepathogenicbacteriawereconfirmedbasedonthepathogensscreeningandartificialchallengeexperiment,andidentifiedaccordingto16SrRNA,gyrBandrpoBgenessequenceandbiochemicalcharacteristics.Publishednucleotidesequencemethodswereusedtostudythevirulencegenes(fimA,citC,gad,mukF,katB,esrBandsodB)byPCRamplification,andPCRprimersforvirulencegenes.[Results]StrainGY15isolatedfrominfectedfishwasprovedtobethepathogenytoCarassiusauratusgibelio.Analysisofthe16SrRNA,gyrBandrpoBgenesequencesoftheGY15gavethehighestidentity(99%)toEdwardsiellatarda.Thiswasfurthersupportedbyphylogenetictreeandbiochemicalcharacteristics.GY15wasidentifiedasE.tarda.IntraperitonealinjectionwithGY15couldleadtoCarassiusauratusgibeliodeath,withavalueofthemedianlethaldose(LD50)of54.26×10CFU/mL.GY15gavepositivePCRresultsfor7virulencegenes.Antibioticsensitivitytestshowedthatamong35antibioticstested,GY15wassensitiveto15antibioticssuchasenrofloxacin,florfenicolandofloxacin,butwasresistantto18antibioticssuchasneomycin,acheomycinandcotrimoxazole.[Conclusion]CarassiusauratusgibeliowasthesusceptiblehostspeciesofE.tarda,whichisanewpotentialthreattocarp’sbreeding.Keywords:Carassiusauratusgibelio,Edwardsiellatarda,Identification,Virulencegenes迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是革兰氏吞噬细胞和胃肠道的酸性物质对病原菌的杀伤作[7]阴性杆菌，属于肠杆菌科。在自然环境和动物内脏用；mukF基因编码杀伤蛋白，对细胞起直接杀[1][8]中均有发现，E.tarda是一种致病性强的水产病伤作用；orfA编码一个重要的分泌蛋白或者膜[2][4]原菌，能导致水产养殖动物全身细菌性败血症，蛋白；esrB是III型分泌系统调节基因；此外，给水产养殖业造成巨大的经济损失。同时，E.tarda还有学者发现sodB基因也是毒力基因，参与抵抗[9]被认为是人鱼共患传染病病原，可导致人类严重肠补体作用。利用PCR方法确认毒力基因在分离[3]胃炎、脑膜炎、败血症和伤口感染等。株中的分布情况，筛选可用于检测致病性迟缓爱E.tarda存在多个毒力基因，利用分子杂交技德华氏菌的毒力基因，对疾病的检测、预防和治术进行基因组学研究发现，该菌有14种毒力基因，疗上应用分子定向进化技术进行研究提供了检测[4]其中只有7种毒力基因存在于致病性的菌株中：手段，最终为建立致病性迟缓爱德华氏菌的PCRfimA、katB、citC、gadB、mukF、orfA和esrB。检测体系提供参考。这7种毒力基因的功能已得到一定程度的研究：本文从患病异育银鲫体内分离到一株E.tarda，fimA编码鞭毛蛋白，帮助病原黏附到宿主细胞表首次报道E.tarda能够感染异育银鲫并导致死亡的[5]面，完成侵入细胞的功能；katB基因编码过氧病例，利用PCR方法检测到该菌存在7种毒力基化氢酶，抵抗有毒的H2O2对细胞膜、酶和DNA因(fimA、katB、citC、gadB、mukF、esrB和sodB)，[6]等细胞组成的损伤；citC基因有帮助分解柠檬酸同时测定其对35种药物的敏感性，最终为致病性的功能；gadB基因参与抵抗酸性条件，从而减轻E.tarda的快速检测和防治措施提供参考。Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 2382微生物学通报Microbiol.China2017,Vol.44,No.101材料与方法用已曝气的自来水换水20%，养殖水温27±1°C并连续充氧。感染期间不投喂饲料，每天观察并记录1.1实验用鱼发病症状和死亡情况，连续观察6d，用TSK法计实验采集滨海基地的濒死异育银鲫，体长[10]算半致死浓度，并取濒死异育银鲫的内脏再次13±2cm，体重76±9g；用于回感试验的健康异育进行细菌的分离、纯化和鉴定。银鲫来自同一滨海基地，健康异育银鲫在实验室环1.5病原菌的鉴定境中暂养15d，用已曝气的自来水换水，每天换1.5.1病原菌的菌落形态观察：将病原菌分别接20%的水量，暂养水温20±1°C，整个养殖过程不种至NA和SS培养基上，28°C培养48h后观察菌间断充氧。落的形态。1.2主要试剂和仪器1.5.2病原菌的生理生化鉴定：取已纯化的单菌营养琼脂培养基(NA)、胰蛋白胨液体培养基落接种至TSA培养基中，28°C培养48h。采用(TSB)、SS培养基和药敏纸片，杭州微生物试剂有ATB系统分析致病菌的生化特征，参照API-32E试限公司；细菌全基因组DNA抽提试剂盒，大连美剂条说明书操作，实验重复2次。仑生物技术有限公司；胶回收试剂盒，Zymoclean1.5.316SrRNA基因测序：(1)菌株GY15全基公司；琼脂糖，美国Lonza公司。ATB系统，法因组的提取。取已纯化的单菌落接种于新鲜的国BioMérieux公司；恒温摇床，上海新苗医疗器TSB培养基中，28°C、140r/min培养20h。取菌械制造有限公司；PCR扩增仪，ThermoFisher液1mL，用细菌全基因组DNA抽提试剂盒提取Scientific公司。PCR引物合成和产物测序由上海DNA，具体操作按说明书进行。迈浦生物科技有限公司完成。(2)16SrRNA基因PCR扩增。25μLPCR反应1.3病原筛查和细菌的分离培养体系：10×Taqbuffer2.5μL，dNTPmix(2mmol/L)将濒死的异育银鲫捞出，用70%的酒精反复1.5μL，MgCl2(25mmol/L)2.5μL，正反向引物擦洗鱼体表面，从鱼体尾静脉取血(血样加入肝素(10μmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，抗凝)，用无菌手术剪剪下鳃丝，手术刀片背部刮DNA模板1μL，DEPC处理水15.25μL。PCR扩取黏液，打开腹腔，无菌分离出肝胰腺、肾脏、肠[11]增条件参照Weisburg等，具体见表1。道，用无菌PBS清洗3次。将取得的病样充分研(3)PCR产物的胶回收纯化、连接转化。16S磨，研磨后的组织匀浆稀释后涂布于营养琼脂rRNA基因的PCR产物采用胶回收试剂盒进行回收(NA)，28°C恒温培养，48h后观察结果。纯化，实验步骤按照试剂盒说明书进行；实验所用1.4腹腔注射感染试验载体为pMD18-T，实验步骤按试剂盒说明书进行。挑取纯化后的单菌落于胰蛋白胨液体培养基1.6多位序列分析(TSB)中，28°C、140r/min恒温培养24h，用无菌1.6.1菌株GY15基因组的提取：菌株GY15基因磷酸缓冲液(PBS：0.01mol/L，pH7.4)十倍稀释法组的提取方法参照1.5.3(1)的方法进行。稀释菌悬液并进行细菌计数。取健康的异育银鲫1.6.2gyrB和rpoB基因的PCR扩增：选取gyrB[12]50尾(体重81±9g)，随机分成5组(4组实验组，1组和rpoB[13]基因进行多位序列分析。PCR扩增体系对照组)，每组10尾鱼。实验组采取腹腔注射方法参照1.5.3(2)，PCR反应条件见表1。36注射100μL，菌浓度为8.5×10−8.5×10CFU/mL，1.6.3PCR产物的胶回收纯化和连接转化：gyrB对照组注射100μL的无菌PBS。腹腔注射感染期和rpoB的PCR产物胶回收纯化、PCR产物连间的异育银鲫置于蓝色塑料桶内(装水50L)，每天接、转化至大肠杆菌感受态细胞，具体步骤参照Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 程俊茗等:鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测23831.5.3(3)进行。全基因组提取方法参照1.5.3(1)的方法进行。1.6.4系统发育分析：将16SrRNA基因的测序结1.7.2毒力基因引物及设计：根据相关参考文献果在数据库中进行比对分析(http://www.ezbiocloud.和GenBank已公布的E.tarda毒力基因，选取[9][14][15][16][17]net/eztaxon/results)；gyrB和rpoB基因的测序结果sodB、katB、esrB、fimA、citC、gadB在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，选取E.和mukF共7种毒力基因，其中gadB和mukF基因tarda及其近缘物种鳗鱼爱德华氏菌(Edwardsiella用PrimerPremier5.0软件设计引物。PCR扩增体系anguillarum)、保科爱德华氏菌(Edwardsiella参照1.5.3(2)，反应条件见表1。PCR扩增产物用hoshinae)和鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)2%的琼脂糖凝胶电泳检测。等相关序列，采用NCBI中的BLAST工具进行核酸1.8药物敏感性测定[18]序列的比对分析，MEGA7.0软件用于基于邻接法参考李楠等的方法，采用K-B纸片扩散法，(Neighbor-Joining，NJ)的16SrRNA基因、gyrB和用无菌棉签蘸取新鲜的菌悬液均匀涂布于TSA培rpoB管家基因的系统进化树的构建，并进行1000养基上。用无菌镊子取药敏纸片轻轻贴附于平板次的Bootstrap重复检验。上，实验设置3个平行，28°C培养30h后测量抑1.7毒力基因的测定菌圈直径。选用恩诺沙星、氟苯尼考、利福平等1.7.1菌株GY15的全基因组提取：菌株GY15的35种药物。表1引物序列及PCR扩增条件Table1Sequencesofprimersandamplificationconditions目的基因引物引物序列参考文献PCR扩增条件TargetgenePrimersPrimerssequence(5′→3′)ReferencesAmplificationconditions16SrRNAgene27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAGWeisburg等[11]94°C5min；94°C30s，54°C30s，72°C1492RGGTTACCTTGTTACGACTT90s，36个循环；72°C10minrpoBrpoB-FGAAAGACCAGGAACGGATCAPridgeon等[12]退火温度为54.1°C，其余反应条件同上rpoB-RAGGTCGTCACGGTAACAAGGgyrBgyrB-FGAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYamamoto等[13]退火温度为61.3°C，其余反应条件同上gyrB-RAGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCsodBsodB-FATGTCATTCGAATTACCTGCYamada等[9]退火温度为53°C，其余反应条件同上sodB-RTCGATGTAATAAGCGTGTTCCCAkatBkatB-FGATGCGATCAAGTTCCCGGAHan等[14]退火温度为54.7°C，其余反应条件同上katB-RACCTGGATGTACAGATCCCATesrBesrB-FGATCATGCCTTGCTAGCCTan等[15]退火温度为53.3°C，其余反应条件同上esrB-RTCGGCGACCAGCTTGAGAgadBgadB-FATTCCCGCTTTGGTTCAGAGenBankAY078505退火温度为53.5°C，其余反应条件同上gadB-RGGAGGAGCCGATAGTATTGGTAfimAfimA-FACAGCCTGGAAGAGTCCTACSakai等[16]退火温度为51.8°C，其余反应条件同上fimA-RTTGAGAGTCGCTGCTTACcitCcitC-FTTTCCGTTTGTGAATCAGGTC江云等[17]退火温度为53°C，其余反应条件同上citC-RAATGTTTCGGCATAGCGTTGmukFmukF-FTTTGGACGGTGAAATGAGCGenBankAY078510退火温度为54°C，其余反应条件同上mukF-RCGTTGCGGTGCCAGTGAATel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 2384微生物学通报Microbiol.China2017,Vol.44,No.102结果与分析肝胰腺、肾脏、肠道组织内平板涂布法分离细菌，结果得到一株菌株命名为GY15。2.1疾病调查及发病状况发病时养殖水体的温度为25−27°C，pH为2.3人工感染及病原菌的再分离58.3±0.2，溶解氧为5.6±0.6mg/L，总氨氮含量为健康的异育银鲫腹腔注射8.5×10CFU/mL的0.50±0.02mg/L，养殖密度约为15000尾/ha，现场菌株GY15后，异育银鲫陆续出现游动缓慢、反死亡率为20%−30%。患病异育银鲫体重为85g左应迟钝等症状。异育银鲫人工感染死亡率统计如5右，初期症状为摄食量减少，伏于池底不动；随表2所示，半致死浓度为4.26×10CFU/mL。部分后病情加重，表现为全身性出血，腹部肿胀，腹鱼出现腹部、鳍条基部严重充血以至出血，肛门红部鳞片基部严重出血(图1)，鳍条充血以至出血，肿等症状。从濒死病鱼的内脏内可分离到菌落形肛门红肿出血并伴有脓样液体流出，胸鳍周围肌态、生理生化特性、16SrRNA、gyrB和rpoB基因肉每隔5−8s抽搐1次，鳃丝呈现紫红色。打开腹序列都与菌株GY15相同的菌株。腔后有黄色浑浊腹水，观察到肝胰腺充血，肠道2.4病原菌的鉴定易断，肠内无食物，鳔壁充血，肌肉充血出血，呈2.4.1菌落形态特征：在NA和TSA培养基上形成现典型的细菌性败血症症状。正圆形、凸起、温润光泽小菌落(48h)；在SS琼脂2.2病原的筛查与细菌分离培养基形成中间为黑色、周边为淡黄色透明的小取自然发病的濒死病鱼检查，从濒死的病鱼菌落(48h)(图2)。图1发病异育银鲫的临床症状Figure1ClinicalsymptomsofdiseasedCarassiusauratusgibelio表2异育银鲫腹腔注射感染菌株GY15的死亡情况统计表Table2MortalityofCarassiusauratusgibeliochallengedwithisolateGY15byintraperitonealinjection每天死亡量注射菌含量死亡率NumberoffishdeadBacterialdose(CFU/mL)Mortality(%)1d2d3d4d5d6d38.5×10000000048.5×100000112058.5×100002406068.5×10154000100对照组(PBS)Control0000000Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 程俊茗等:鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测2385PCR扩增和测序，分别得到了1410bp(16SrRNA基因)、1164bp(gyrB)和914bp(rpoB)的基因片段。将GY15菌株的16SrRNA、gyrB和rpoB基因序列在NCBI上进行同源性检索并构建系统进化树，结果显示，在以上3个基因的系统进化树中，GY15均与E.tarda聚在一起(图3−5)。2.5毒力基因的测定毒力基因用设计的7种毒力基因的特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，7种毒力基因均被检测到：sodB(490bp)、katB(377bp)、图2GY15在SS培养基上的菌落形态esrB(454bp)、gadB(308bp)、fimA(839bp)、citCFigure2ColonialmorphologyofthestrainGY15inSS(553bp)和mukF(303bp)(图6)。2.4.2生化特性：采用API-32E鉴定系统对致病菌以上测序结果在NCBI进行比对分析，sodBGY15进行生理生化指标的测试。GY15经鉴定为迟基因与E.tarda(AB232350.1和AB009853.1)相似缓爱德华氏菌(表3)，其鉴定百分率值为99.8%。性达100%；katB基因与E.tarda(HQ407402.1和2.4.3致病菌的系统进化分析：为确定其分类地CP002154.1)相似性达99%；esrB基因与E.tarda位，采用16SrRNA基因测序与多位序列分析相结(AY643478.1和KM267087.1)相似性达98%；gadB合的方法进行致病菌GY15的系统进化分析。经基因与E.tarda(AY078505.1和CP004441.1)相似表3菌株GY15的API-32E鉴定结果Table3ResultsofAPI-32EbacteriaidentificationofstrainGY15生化项目Biochemicalitems结果Results生化项目Biochemicalitems结果ResultsL-阿拉伯醇L-Arabitol−L-阿拉伯糖L-Arabinose−D-甘露醇D-Mannitol−肌醇Inositol+丙二酸盐Usageofmalonicacid−D-半乳糖酸盐同化D-Galactoseassimilation−D-阿拉伯醇D-Arabitol−D-纤维二糖D-Cellobiose−L-天冬氨酸芳胺酶L-Aspartatearylamidase−侧金盏花醇Adonitol−精氨酸双水解酶Argininedihydrolase−肌醇Inositol−D-海藻糖D-Trehalose−β-葡萄糖醛酸酶β-Glucuronidase−β-葡萄糖苷酶β-Glucosidase−β-半乳糖苷酶β-Galactosidase−α-麦芽糖α-Maltose−α-葡萄糖苷酶α-Glucosidase−D-麦芽糖D-Maltose+尿素酶Urease−βN乙酰葡萄糖胺βN-Acetylglucosamine−D-山梨醇D-Sorbitol−蔗糖Saccharose/sucrose−酚红Phenolred+L-鼠李糖L-Rhamnose−古老糖Palatinose−鸟氨酸脱羧酶Ornithinedecarboxylase+α-半乳酸苷酶α-Galactosidas−注：−：阴性；+：阳性.Note:−:Negative;+:Positive.Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 2386微生物学通报Microbiol.China2017,Vol.44,No.10图3菌株GY15的16SrRNA基因的系统进化树Figure3Phylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesofstrainGY15注：标尺：表示序列差异的分支长度；括号内的数字为GenBank序列号；节点处的数字为Bootstrap值；括号内为GenBank数据库的登录号.Note:Bar:Nucleotidedivergence;NumbersinparenthesisrepresentedGenBankaccessionnumber;NumbersatthebranchpointsindicatedtheBootstrapvalues;ThoseinparenthesesareGenBankaccessionnumber.图4菌株GY15的gyrB基因的系统进化树Figure4PhylogenetictreebasedongyrBgenesequencesofstrainGY15图5菌株GY15的rpoB基因的系统进化树Figure5PhylogenetictreebasedonrpoBgenesequencesofstrainGY15Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 程俊茗等:鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测2387图67个毒力基因PCR扩增结果Figure6ThePCRresultsofsevenkindsofvirulencegenes注：M：MarkerDL2000；C：阴性对照；1−3、4−6、7−9、10−12、13−15、16−18和19−21分别为用sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC和mukF基因的引物进行扩增获得的PCR产物.Note:M:MarkerDL2000;C:Negativecontrol;1−3,4−6,7−9,10−12,13−15,16−18and19−21:PCRamplificationusedtheprimersofsodB,katB,esrB,gadB,fimA,citCandmukFgene,respectively.Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 2388微生物学通报Microbiol.China2017,Vol.44,No.10性达98%；fimA基因与E.tarda(AB100170.2和2.6病原菌的药物敏感性实验CP001135.1)相似性达99%；citC基因与E.tarda采用K-B纸片扩散法进行菌株GY15的药物敏(CP002154.1和CP001135.1)相似性达99%；mukF感性实验，结果显示：菌株GY15对恩诺沙星、氟基因与E.tarda(CP002154.1和CP001135.1)相似性苯尼考和氧氟沙星等15种药物敏感，对新霉素、四达99%。环素和复方新诺明等18种药物表现为耐药(表4)。表4菌株GY15对35种药物敏感性测试Table4SusceptibilitytoantibioticsresultsofstrainGY15药物浓度抑菌圈直径药物浓度抑菌圈直径药物敏感程度药物敏感程度DosageDiameterofDosageDiameterofAntibioticSensitivityAntibioticSensitivity(μg/disc)inhibition(mm)(μg/disc)inhibition(mm)恩诺沙星10.0018S头孢拉定30.005REnrofloxacinCefradine氟苯尼考30.0030S头孢氨苄30.008RFlorfenicolCefalexin利福平5.009R新霉素30.008RRifampicinNeomycin链霉素10.000R万古霉素30.000RStreptomycinVancomycin头孢曲松30.0029S头孢唑啉30.0021SCefatriaxoneCefazolin头孢噻酚30.000R哌拉西林100.0023SCefalothinPiperacillin头孢他啶30.0025S庆大霉素10.0014ICeftazidimeGentamycin克林霉素2.000R羧苄西林100.0022SClindamycinCarbenicillin氯霉素30.0032S环丙沙星5.0019SChloramphenicolCiprofloxacin红霉素15.009R卡那霉素30.000RErythromycinKanamycin头孢呋辛30.0020S丁胺卡那30.0022SCefuroximeAmikacin呋喃唑酮300.0020S氨苄西林10.006RFuraxoneAmpicillin米诺环素30.0014I氧氟沙星5.0016SMinocyclineOfloxacin多西环素30.004R麦迪霉素30.000RDoxycyclineMidecamycin四环素30.002R头孢哌酮75.0024SAcheomycinCefoperazone多黏菌素300IU6R诺氟沙星10.0018SPolymyxinBNorfloxacin复方新诺明23.750R苯唑西林1.000RCotrimexazoleOxacillin青霉素10U0RPenicillin注：S：高度敏感(抑菌圈直径>15mm)；I：中度敏感(10≤抑菌圈直径≤15)；R：低度敏感或不敏感(0≤抑菌圈直径<10).Note:S:Highlysensitive(Diameterofinhibitionzone>15mm);I:Moderatelysensitive(10≤Diameterofinhibitionzone≤15);R:Lowsensitivityorinsensitivity(0≤Diameterofinhibitionzone<10).Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 程俊茗等:鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测23893讨论katB)未检测出，认为选择任意一种基因(fimA、gadB、citC和mukF)都可作为致病性E.tarda的检随着水产养殖业的逐步扩大，高密度的养殖[29]测对象。赵飞等扩增出地图鱼E.tarda的fimA模式导致病害频发，爱德华氏菌病也日趋严重。[30][19][20][21]基因；朱文进等认为fimA毒力基因存在于致病E.tarda可以感染黑鲈、大菱鲆、虹鳟、欧[22]性迟缓爱德华菌中，可作为快速检测致病性迟缓爱洲鳗鲡等。近几年有学者报道E.tarda也可以感[31][23]德华菌的标志物；张晓君等对10株E.tarda的染齐口裂腹鱼，本研究首次报道了在异育银鲫4种毒力基因(fimA、fimB、gadB及citC)进行扩增，养殖过程中E.tarda作为潜在的细菌性病原体也可结果显示4种毒力基因在10株E.tarda中均存在；以感染异育银鲫导致死亡的案例，说明E.tarda的[32]管峰等检测港口航道水域中E.tarda的6种毒力宿主范围在扩大，需要引起重视。基因，但只检测到2种毒力基因(fimA和gadB)；贾本实验从濒死异育银鲫体内分离到一株[33]俊涛等检测到导致大菱鲆发病的E.tarda的3种GY15，运用分子生物学方法测定16SrRNA、gyrB毒力基因(fimA、gadB和citC)。综合本实验和国内和rpoB基因。16SrRNA基因具有高度的保守性和[24]文献报道的毒力基因，认为利用fimA和gadB毒力特异性，是种属鉴定的分子基础。16SrRNA基基因可以对E.tarda进行快速检测。因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的强有力工本试验选取的药物并非均可用于养殖环境，其具，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量[25]中氯霉素、环丙沙星、万古霉素、呋喃类和头孢类和准确的分类鉴定，但是对于水产病原菌例如等抗生素已被农业部列为禁药，结合养殖户常见药气单胞菌属和弧菌属，16SrRNA基因的种间相似物，推荐使用恩诺沙星、氟苯尼考和诺氟沙星对迟度高达99%以上，该技术的特异性和灵敏度一直存在争议[26]。多位点序列分型MLST(Multilocus缓爱德华氏菌病进行治疗。本文通过常规PCR方法扩增到7个毒力基因，sequencetyping)是基于看家基因内部片段的序列进一步明确了E.tardaGY15的毒力基因携带情多态性，对多个管家基因扩增、测序并对扩增序列况，可为进一步研究核酸疫苗、亚单位疫苗和快速进行比对分析，具有很高的分辨率，可以准确反映细菌群体的变异进化[27]，为流行病学监测、微生检测试剂盒的开发奠定基础，为该菌的快速检测和物分型和微生物进化的基础研究提供了一种简便防治奠定了基础。[28]可行的方法。因此，本文运用16SrRNA基因、参考文献管家基因gyrB和rpoB同时结合生理生化实验，综[1]AmandiA,HiuSF,RohovecJS,etal.Isolationand合判定导致异育银鲫死亡的致病菌为E.tarda。characterizationofEdwardsiellatardafromfallchinooksalmon(Oncorhynchustshawytscha)[J].AppliedandEnvironmental本实验扩增并检测出E.tarda的7种毒力基Microbiology,1982,43(6):1380-1384[2]MohantyBR,SahooPK.Edwardsiellosisinfish:abriefreview[J].因，与国内已报道菌株的毒力基因有差异，是对JournalofBiosciences,2007,32(S3):1331-1344国内有关E.tarda毒力基因研究的补充。有文献报[3]JandaJM,AbbottSL.Expressionofaniron-regulatedhemolysinbyEdwardsiellatarda[J].FEMSMicrobiologyLetters,1993,[4]道利用基因组学进行毒力基因的研究，7个毒力111(2/3):275-280[4]SrinivasaRaoPS,LimTM,LeungKY.Functionalgenomics基因(orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF、esrB)approachtotheidentificationofvirulencegenesinvolvedin只在致病性的迟缓爱德华氏菌分离株中被发现。其Edwardsiellatardapathogenesis[J].InfectionandImmunity,2003,71(3):1343-1351中orfA基因的序列未提交，因此无法设计引物。[5]SakaiT,KanaiK,OsatomiK,etal.Identificationofa19.3-kDaproteininMRHA-positiveEdwardsiellatarda:putativefimbrial不同的学者选用不同的目标毒力基因进行检测，如majorsubunit[J].FEMSMicrobiologyLetters,2003,226(1):江云等[17]选取了6种毒力基因，扩增出4种(fimA、127-133[6]MatthewJA,TanYP,SrinivasaRaoPS,etal.EdwardsiellatardagadB、citC和mukF)毒力基因，另外2种(esrB和mutantsdefectiveinsiderophoreproduction,motility,serumTel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 2390微生物学通报Microbiol.China2017,Vol.44,No.10resistanceandcatalaseactivity[J].Microbiology,2001,147(2):inwildeuropeaneelsAnguillaanguillafrommediterranean449-457spain[J].DiseasesofAquaticOrganisms,2006,73(1):77-81[7]Casterine-CornetMP,PenfoundTA,SmithD,etal.Controlof[23]ZhouY,GengY,WangKY,etal.EdwardsiellatardainfectionacidresistanceinEscherichiacoli[J].JournalofBiosciences,inculturedYa-fish,Schizothoraxprenanti,inChina[J].1999,181(11):3525-3535AquacultureResearch,2014,47(7):2349-2354[8]JinF,KunitoshiY,HironoriN,etal.Newkillingsystem[24]JanssenPH.Identifyingthedominantsoilbacterialtaxaincontrolledbytwogeneslocatedimmediatelyupstreamofthelibrariesof16SrRNAand16SrRNAgenes[J].AppliedandmukBgeneinEscherichiacoli[J].MolecularandGeneralEnvironmentalMicrobiology,2006,72(3):1719-1728Genetics,1994,243(2):136-147[25]LiuY,CuiXL,LiWJ,etal.ApplicationofRNAsecondary[9]YamadaY,WakabayashiH.Identificationoffish-pathogenicstructureinphylogeneticanalysisofmicrobiology[J].strainsbelongingtothegenusEdwardsiellatardabysequenceMicrobiologyChina,2006,33(2):147-150(inChinese)analysisofsodB[J].FishPathology,1999,34(3):145-150刘杨,崔晓龙,李文均,等.RNA二级结构在微生物系统发育[10]HamiltonMA,RussoRC,ThurstonRV.Trimmed分析上的应用[J].微生物学通报,2006,33(2):147-150Spearman-Karbermethodforestimatingmedianlethal[26]Martinez-MurciaAJ,BenllochS,CollinsMD.Phylogeneticconcentrationsintoxicitybioassays[J].EnvironmentalScienceinterrelationshipsofmembersofthegeneraAeromonasandandTechnology,1977,11(7):714-719Plesiomonasasdeterminedby16SribosomalDNAsequencing:[11]WeisburgWG,BarnsSM,PelletierDA,etal.16SribosomallackofcongruencewithresultsofDNA-DNAhybridizations[J].DNAamplificationforphylogeneticstudy[J].JournalofInternationalJournalofSystematicBacteriology,1992,42(3):Biosciences,1991,73(2):697-703412-421[12]PridgeonJW,KlesiusPH,Yildirim-AksoyM.Attempttodevelop[27]UrwinR,MaidenMC.Multi-locussequencetyping:atoolforliveattenuatedbacterialvaccinesbyselectingresistancetoglobalepidemiology[J].TrendsinMicrobiology,2003,11(10):gossypol,proflavinehemisulfate,novobiocin,orciprofloxacin[J].479-487Vaccine,2013,31(8):2222-2230[28]JiXW,LiaoYL,MaoXH,etal.MLSTofthepathogenic[13]YamamotoS,HarayamaS.PCRamplificationanddirectmicroorganismgenotypingresearchprogressinapplication[J].sequencingofgyrBgeneswithuniversalprimersandtheirInternationalJournalofLaboratoryMedicine,2011,32(2):applicationtothedetectionandtaxonomicanalysisof246-249(inChinese)Pseudomonasputidastrains[J].AppliedandEnvironmental姬小薇,廖亚玲,毛旭虎,等.MLST分析在病原微生物基因分型Microbiology,1995,61(3):1104-1109[14]HanHJ,KimDH,LeeDC,etal.PathogenicityofEdwardsiella应用中的研究进展[J].国际检验医学杂志,2011,32(2):246-249tardatooliveflounder,Paralichthysolivaceus(Temminck&[29]ZhaoF,ZouWM,TanAP,etal.IdentificationanddetectionofSchlegel)[J].JournalofFishDisease,2006,29(10):601-609virulencegeneofthepathogenicbacteriaEdwardsiellosisinoscar[15]TanYP,ZhengJ,TungSL,etal.RoleoftypeIIIsecretioninAstronotusocellatu[J].JournalofDalianFisheriesUniversity,Edwardsiellatardavirulence[J].Microbiology,2005,151(7):2007,22(6):403-408(inChinese)2301-2313赵飞,邹为民,谭爱萍,等.地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴[16]SakaiT,YuasaK,SanoM,etal.IdentificationofEdwardsiella定及毒力基因的检测[J].大连水产学院学报,2007,22(6):403-408ictaluriandE.tardabyspecies-specificpolymerasechain[30]ZhuWJ,ChenCZ,SuYM,etal.Detectionandsequencingofreactiontargetedtotheupstreamregionofthefimbrialgene[J].virulencegenesofpathogenicEdwardsiellatardainParalichthysJournalofAquaticAnimalHealth,2009,21(2):124-132olivaceus[J].ProgressinVeterinaryMedicine,2014,35(11):[17]JiangY,LiSS,WangSK,etal.Detectionofthevirulencegenes20-24(inChinese)ofpathogenicEdwardsiellatardabyPCRassay[J].Journalof朱文进,陈翠珍,苏咏梅,等.牙鲆致病性迟钝爱德华菌毒力ChineseInstituteofFoodScienceandTechnology,2008,8(4):123-129(inChinese)基因的检测及序列分析[J].动物医学进展,2014,35(11):20-24江云,李寿崧,王寿昆,等.致病性迟钝爱德华氏菌毒力基因[31]ZhangXJ,BaiXS,BiKR,etal.VirulencegenesanddulplexPCRandtheLAMPmethodsforthedetectionofpathogenic的PCR检测[J].中国食品学报,2008,8(4):123-129Edwardsiellatarda[J].JournalofFisheriesofChina,2013,37(7):[18]LiN,GuoHZ,JiaoR,etal.Identificationandpathogenicityof1087-1094(inChinese)bacterialpathogensisolatedinanoutbreakonbacterialdiseaseof张晓君,白雪松,毕可然,等.病原迟钝爱德华菌毒力基因及双Ctenopharyngodonidellus[J].ActaHydrobiologicaSinica,2011,重PCR与LAMP检测方法的建立[J].水产学报,2013,37(7):35(6):980-987(inChinese)李楠,郭慧芝,焦冉,等.草鱼的一种急性细菌性传染病病原的1087-1094[32]GuanF,ChenJG,MaoZJ,etal.Virulencegeneticstudiesof分离鉴定及致病性研究[J].水生生物学报,2011,35(6):980-987pathogenicbacteriainNingbo-Zhoushanportandchannelwaters[J].[19]BlanchAR,PintoRM,JofreJT.IsolationandcharacterizationofJournalofAppliedOceanography,2016,35(2):183-189(inanEdwardsiellasp.strain,causativeagentofmortalitiesinseabassChinese)(Dicentrarchuslabrax)[J].Aquaculture,1990,88(3/4):213-222管峰,陈吉刚,毛芝娟,等.宁波-舟山港口航道水域致病性细[20]NougayredePH,VuillaumeA,VigneulleM,etal.Firstisolation菌的毒力基因型鉴定[J].应用海洋学学报,2016,35(2):183-189ofEdwardsiellatardafromdiseasedturbot(Scophthalmusmaximus)rearedinaseafarmintheBayofBiscay[J].Bulletinof[33]JiaJT,ChenJX,LuLL,etal.IdentificationandstudyonthetheEuropeanAssociationofFishPathologists,1994,14:128-129virulencegeneofEdward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