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1、小鼠前向运动精子分离采集技术改良论文.freelousespermcollectionismonusedinmanyfieldsoflifesciencecurrently.Theaimofthisresearchisinordertoimprovetheratioofforotilespermcollectingfrommouseepididymides.MethodAnovel"doublechambersdish"andconvenient"doublechamberss"methodup"methodonusednoentsshootilespermsoutactively
2、fromtheinnerchamberandtherateofforotilespermincreased.Spermdifferentsideofthesamemousebyusing"conventionalsup"or"doublechamberss"method,respectively.ResultThemeansoftherateofforotilespermcollectedup”groupand77.33%±5.69%berss”group,respectively.Statisticalanalysisshoberss”methodcanimprovethera
3、tiooftheforotilespermstablyandobservablyandethodinmousespermcollection.KEY16按文献3配制,配方主要成分为:NaCl,KCl,KH2PO4,MgSO4·7H2O,乳酸钠,葡萄糖,青霉素,链霉素,碳酸氢钠,丙酮酸钠,氯化钙(均为国产分析纯试剂),BSA(FractionⅤ,美国SigmaA3311);胚胎培养级轻质矿物油(Sigma,M8410),氯仿(广东汕头西陇化工厂),生理盐水(福州海王福药制药有限公司)。1.2方法1.2.1“B法”精子采集方案设计“A法”是在直径35mm的培养皿中央加入约1.0mL培养液形
4、成一个液滴,液滴四周及其表面覆盖矿物油;小鼠附睾尾放在液滴中央剪开,使精液从组织中扩散到培养液里;培养一段时间后从液滴的上层吸取悬液以收获游出的精子(图1A)。本研究设计的“B法”在上述培养皿中央增加2个直径不同的同心圆环,制成“双舱培养皿”。内环加入培养液并使其溢出至外环形成一个大液滴,液滴覆盖的区域构成内、外半隔断的2个“舱”;小鼠附睾尾放在内舱中剪开,精液只在内舱中扩散,而前向运动精子则可以跨越内环而游到外舱;培养一段时间后从外舱底部吸取悬液以收获游出的精子,大部分运动功能差及或死亡的精子将被挡在内舱而被排除(图1B),从而分离出前向运动精子。1.2.2双舱培养皿制作用手术刀平整
5、切下0.5mLEP管内盖上凸出的圆环(直径约8mm,高约3mm),于氯仿中浸泡下缘3min左右,镊子夹起圆环立即贴于35mm塑料培养皿中央作为内环;再从20mL塑料注射器上剪下一圈圆环(直径约22mm,高约2mm)同法浸泡后套在内环之外作为外环,高度略矮于内环。内外2圆环组成同心圆,确认内外环都贴紧培养皿而无缝隙,即制成双舱培养皿(图2),内环之内的区域称为内舱,内、外环之间的区域称为外舱。1.2.3附睾尾取材在超净工作台无菌条件下操作。“脊椎错位法”处死小鼠,仰卧,酒精喷洒体表消毒,在其下腹部横向剪开一道小口,纵向撕开,暴露腹壁肌肉,组织镊捏起膀胱投影区上方腹壁肌肉,轻微抖动避免内脏
6、粘连,提起后横向剪开至腹壁两侧,充分暴露其下脂肪囊;拉出脂肪囊,暴露睾丸和附睾,镊子夹住附睾体的尾部末端,剥离附睾尾周围的脂肪和血管,沿镊子夹取部位剪下双侧附睾尾,放入生理盐水中清洗表面残留脂肪及血污。1.2.4精子采集每次实验对同一只小鼠左右两侧附睾尾分别随机编为A、B组:A组将附睾尾置于培养皿液滴中央,采用“A法”采集精子;B组将附睾尾置于培养皿内环中,采用“B法”采集。切碎附睾尾时注意动作尽量轻巧,避免过分振动。将培养皿移入培养箱中,37℃、体积分数为0.05%的CO2培养15min后移出至超净台上,用1000μL可调微量移液器分别从2组吸取500μL精子悬液并装入2个1.5mL
7、EP管中。A组从液滴的上层吸取悬液,B组则从外舱的底部贴近内环处吸取悬液(图1)。将EP管中的1只移回培养箱中培养等待检查,另1只EP管的精子悬液立即进行显微观察与计数。1.2.5显微观察与计数用200μL可调微量移液器对EP管中的精子悬液反复吹吸数次使精子混匀,吸取40μL精子悬液滴加在载玻片上,覆盖盖玻片后观察。对盖玻片中央和四角(避免盖玻片边沿)的5个区域内精子进行观察和计数。利用血球分类计数器对“前向运动精子”和“非前向运动精子”的数目