人细小病毒b19中国株vp1蛋白独特区基因片段序列变异分析论文

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1、人细小病毒B19中国株VP1蛋白独特区基因片段序列变异分析论文.freelan;cloningmolecular;se-quenceanalysisAbstract:AIMToobtainandsequenceDNAcloneofVP1uniqueregionofhumanparvovirusB19fromChinesepatientsandtofurtherstudythegeicmutationofhumanpar-vovirusB19oftheChinesestrain.METHODSTplesofVP1uniqu

2、eregionofHPVB19plifiedfromaplas-ticcrisisserumoftententof480bpplifiedbyPCRfromtheserumsamplesofonepatient.paredinoacidutationsinthenucleotidesequenceencodingtheuniqueregionofVP1ofhumanparvovirusB19oftheChinesestrain.0引言许多研究表明，人细小病毒B19（HPVB19）与人类多种疾病密切相关［1-4］，可致孕妇

3、流产、死胎及儿童传染性红斑、一过性再生障碍性贫血危象（TAC）、急性血小板减少性紫癜等疾病.近年有报道各国的流行株有变异［5-7］，我国尚缺乏此方面的研究.为了揭示我国B19病毒流行株的核苷酸序列及变异特点，我们克隆和分析了VP1独特区基因，以便为制备诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础.1材料和方法1.1材料搜集1999-12我院儿科再生障碍性贫血患儿血清标本2份，-20℃冰箱保存备用待检.根据HPVB19DNA全序列［8］，自行设计VP1独特区引物一对，上游引物位于2444-2466位碱基，并在5’末端引入BamHI酶切位

4、点，序列为AAGGATCCAT-GAGTAAAGAAAGTGGCAAATG;下游引物位于2901-2923位碱基，并在5’末端引入SalI酶切位点，序列为AGTCGACTCACAGTTGGCTATACCTA-AAGTCAT，该引物扩增的靶序列为480bp，引物由上海生工生物工程公司合成.HPVB19阳性对照模板质粒由沙特皇家医院研究中心（KFSHResearchCenter）提供，经提纯后含量为70μgL-1.TaqDNA聚合酶、PCR相对分子质量标记、SalⅠ，BamHⅠ，T4DNA连接酶、琼脂糖DNA回收试剂盒等均购

5、自华美生物工程公司.1.2方法1.2.1血清标本DNA的提取按已报告的方法［9］，提取DNA为PCR反应的模板.1.2.2PCR反应50μL反应体系中，双蒸水31μL，10×PCRbuffer5μL，4×dNTP4μL，25mmolL-1MgCl23μL，上游引物和下游引物各1μL（20pmol），DNA模板5μL（阳性对照1μL，阴性对照以双蒸水为模板），Taq酶33.34nkat，93℃1min，55℃90s，72℃1min，35个周期循环后，72℃充分延伸10min，20gL-1琼脂糖凝胶电泳、EB染色并回收PCR

6、产物.1.2.3重组质粒的构建BamHI，SalI酶切回收的PCR产物及PUC19载体，经37℃水浴5h，回收酶切完全的PCR产物和PUC19，16℃加T4DNA连接酶连接过夜，65℃5min失活连接酶.应用氯化钙制备新鲜感受态细胞，将PCR产物与PUC19的连接反应液转化100μL大肠杆菌XL1Blue感受态细胞，经培养，在含X-gal和IPTG的LB平板上筛选白色菌落，培养增菌后提取质粒，并以BamHI和SalI酶切确定其正确性.1.2.4DNA序列测定在上海基康公司用ABI3700自动测序仪测序.2结果2.1PCR

7、扩增HPVB19VP1独特区片段用所设计引物结果扩增出HPVB19VP1片段，在相当于位置480bp显示其核苷酸片段大小与预期值一致（Fig1），阴性对照未扩增出特异片段.2.2VP1┐PUC19重组质粒的构建将上述阳性扩增产物HPVB19VP1基因与克隆载体PUC19连接，获得重组质粒HPVB19VP1-PUC19，再将重组质粒用BamHI和SalI双酶切，得到一条480bp片段，证明目的片段已正确插入PUC19载体（Fig2）.图1－图2略2.3HPVB19VP1独特区克隆测序如Fig3所示，与B19ed，1997;

8、48:59-67.［2］CarlosDR，StephenCE.Infection-relatedarthritis［J］.RheumDisClinNorthAm，1997;23（3）:677-695.［3］Broaryfoetalliverculture［J］.JGenVi-rol，1991;72:741-745.［