两种方法制作大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型比较论文

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1、两种方法制作大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型比较论文厉建元张亚卓姚维成桂松柏孙梅珍【摘要】目的制作短暂性大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型，比较颈总动脉进线法和颈外动脉进线法(改良LONGA法)优劣。方法颈总动脉进线法和改良LONGA法栓塞大鼠大脑中动脉，栓塞2h后再灌注24h，以LONGA法标准对模型评分，并对梗死体积进行测定，7d时流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果改良LONGA法和颈总动脉进线法神经行为学评分分别为2.30±0.82和1.00±0.63，两种方法比较差异有显著性（t=6.886,P0.05）；两法脑梗死体

2、积相比差异有显著性(t=3.96～4.45,P0.05)；两法细胞凋亡率比较差异有显著性（F=348.46，q=22.89,P0.05）。结论与颈总动脉进线法相比.freelakeatransientmiddlecerebralarteryocclusionmodelinrats,andtoparethemethodsofocclusionofmoncarotidarteryandLONGA’stechnique.MethodsThecerebralarteryocclusiononcarotidartery(CC

3、A)orexternalcarotidartery(modifiedLONGA’sgroup).AfterteofcerebralinfarctionatedbyTTCstaining.Thenumberofapoptoticcellsetryaftersevendaysofocclusion.ResultsTheneurologicalbehaviorscoringsinmodifiedLONGA’sgroupandCCAgroupebetberofapoptoticcellsodifiedLONGA’sgrou

4、peberofapoptoticcellsa公司），40g/L的甲醛（北京市化学试剂厂），凋亡试剂盒（Sigma公司）等。1.3实验器材常规手术器械及显微手术器械各一套，手术显微镜，双极电凝等。1.4实验方法1.4.1线栓制作选用日本进口鱼线［1］。将头端烧成一光滑圆球，直径在0.36mm左右，千分尺筛选。圆球制成后在距头端5、16～18和20～22mm处进行标记，浸泡于体积分数0.75的乙醇中备用。1.4.2处理方法SD大鼠称质量后以10g/L水合氯醛按4mg/100g体质量腹腔麻醉，暴露颈部，备皮，乙醇消毒。然

5、后，分别按照CCA进线法和ECA进线法［3,4］建立模型，栓塞2h后再灌注24h，成功后放回笼中卫生饲养。对照组不做任何处理，假手术组按照实验组步骤处理，但是不插入线栓。每天观察动物情况。1.4.3神经功能缺失评分及TTC染色按LONGA等［5］及文献［6］的标准于术后24h行5分制评分。按照再灌注后不同时间，将大鼠断头取脑去除小脑等组织后放于生理盐水中，置于-20℃冰箱10min，用特制刀片（共5片，相邻刀片间隔2mm）沿冠状面切成2mm厚的脑片,浸入37℃的20g/LTTC-磷酸盐缓冲液中,37℃水浴15～30

6、min，数码相机照相。梗死体积由以下公式计算：梗死体积=（总体积-对侧未梗塞体积-梗塞侧未梗塞体积）/对侧未梗塞体积×100%。1.4.4苏木精-伊红（HE）染色按照实验设计时间取对照组、假手术组及实验组大鼠右侧大脑行常规HE染色，中性树胶封片后置于显微镜下观察，数码相机拍照。1.4.5凋亡实验取脑前步骤相同，待生理盐水灌注流出液澄清时开颅取脑。取部分脑组织用小平皿研磨，研磨时加入含体积分数0.03胎牛血清的PBS1mL，然后将其移入10mL离心管，向离心管中加入2.5g/L的EDTA+50g/L的胰酶3mL，37

7、.5～37.8℃消化30min，期间振荡2～3次；取上述消化后脑组织，用120～150目滤网过滤，加入冰PBS至10mL，1000r/min离心5min，弃上清。再次PBS清洗，1000r/min离心5min；用1×BindingBuffer缓冲液制成1×109/L的细胞悬液；按照说明书设置对照组、单染组及实验组，并按说明加入AnnexinⅤ与核酸染料（2008.2.29Cat.No.556547，Lot65061）。具体如下：设置4管，在Falcon试管中加入100μL上述细胞悬液。然后，空白管不加任何试剂；An

8、nexinⅤ单染管加入5μLAnnexinⅤ；核酸染料加入15μLPI；双染管先加入5μLAnnexinⅤ，再加入15μLPI。轻轻混匀，室温（20～25℃）避光处置20min；各试管中分别加入1×BindingBuffer缓冲液至400mL，过滤，上流式细胞仪测定细胞凋亡情况。2结果2.1模型成功率比较本文102只大鼠，据行为学评分,评分为0~4分和在此之