细胞膜表达的hlag诱导免疫耐受性树突状细胞的产生论文

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1、细胞膜表达的HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生论文周浩黎纬明张敏刘峥嵘邹萍【摘要】为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞(dendriticcell,DC)产生的方法及其机制，利用人HLAG1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后，用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明，膜表达的HLAG1分子与树突状细胞作用后，DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调，而抑制性分子ILT3

2、、ILT4表达上调。HLAG1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLAG1分子可以在体外条件下，下调DC表面免疫共刺激分子水平.freelbraneBoundHLAGAbstractInordertostudyhoechanism,theK562cellstransducedmunologicalchanges,suchasmembranemoleculesCD80,CD86,ILT3andILT4expressionlevelsetry.Allogeneicproliferat

3、ionofperipheralbloodmononuclearcells(PBMNC)ixedlymphocytereaction.TheresultsshoulatetheallogenicPBMNC.ItisconcludedthatthemembraneboundHLAGcanupregulateexpressionofinhibitoryreceptorsILT3andILT4,inducingtolerogenicDCinvitro,ayprovideanovelstrategyfortransp

4、lanttoleranceinduction.Keyphocyte;immunetolerance移植排斥所导致的移植物抗宿主病（GVHD）是骨髓移植领域的难题。目前临床免疫抑制剂的应用虽然可以显著降低急性GVHD的发生，但是慢性GVHD损害的发生仍然难以克服。诱导受者外周免疫耐受被认为可能成为解决移植后慢性GVHD的有效途径［1］。树突状细胞（dendriticcell，DC）是体内功能最强的专业性抗原呈递细胞，是活化初始CD4+T细胞最有效的抗原呈递细胞。近年来，人们逐渐认识到DC在外周免疫耐受中的作用，并

5、寻找诱导免疫耐受性树突状细胞产生的有效途径［2］。免疫耐受性树突状细胞膜上高表达ILT3和ILT4分子，它们的可能配体是HLAG［3］。研究发现，HLAG促进心脏移植后的外周免疫耐受状态的产生，其机制可能与诱导树突状细胞耐受有关［4］。本实验希望通过对HLAG诱导DC免疫耐受的机制的研究，探讨诱导免疫耐受性DC产生的新的有效方法。材料和方法主要试剂、细胞株及HLAG1真核表达质粒RPMI1640培养液、DMEM培养液、G418、TRIZOL一步法提取RNA试剂及逆转录试剂盒均购于Gibco公司，Lipo

6、fectamine2000脂质体转染试剂盒购于Invitrogen公司，小牛血清购于杭州四季青公司。慢性粒细胞白血病细胞株K562、绒毛膜癌细胞株JEG3细胞来源于ATCC，培养于含15%小牛血清的RPMI1640培养液中。包括人HLAG1全长cDNA的真核表达质粒由CaroleOber博士惠赠。K562细胞的转染及药物筛选脂质体介导的真核细胞转染技术参照Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒说明进行。转染细胞在800μg/ml浓度G418条件下筛选稳定株。稳定转染细胞株表示为K562HLA

7、G1，转染空载体的细胞株表示为K562RSV。抗体和流式细胞术小鼠抗人HLAG1单克隆抗体(MEMG/9)购自BioVender公司。小鼠抗人HLADR、CD1a、ILT3、ILT4、CD80、CD86抗体，PE标记小鼠抗人CD1a抗体均购自RD公司。FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗小鼠IgG免疫磁珠购自晶美公司。流式细胞术分析前，将细胞与含20%人血清的PBS作用以封闭Fc受体。并用同型对照抗体以系统性消除非特异性结合。流式细胞分析采用CellQuest软件。外周血来源树突状细胞培养及细胞的共

8、培养取新鲜的人肝素抗凝外周血20ml，用PBS以1∶1的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，2000×g离心20分钟后取白膜层细胞，用PBS以1500×g离心10分钟洗涤2次，并用RPMI1640以1000×g离心10分钟，洗涤1次，最后用含10%(v/v)胎牛血清RPMI1640完全培养液重悬细胞，以2×106cells/ml细胞浓度加到24孔培养板中，每孔1ml。放置37