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《抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白相互作用蛋白编码基因c1的反式调节基因》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白相互作用蛋白编码基因C1的反式调节基因：蔺淑梅,张树林,成军,刘敏,郭江,张黎颖,杨媛【关键词】抑制性消减杂交；反式激活；克隆;,乙型肝炎病毒【Abstract】AIM：TocloneandidentifyhumangenestransactivatedbyhumangeneC1encodingproteinC1interactingaticstechniquesRNAHepG2cellstransfectedptyvector,respectively,SSHmeth
2、odployedtoanalyzethedifferentiallyexpressedcDNAsequencebeteRsaIdigestion,smallsizescDNAserasechainreaction(PCR）tidvectorstosetupthesubtractivelibrary.Amplificationofthelibraryedin30clones，atrandom,andthefulllengthsequencesaticsmethod.Altogether18codingsequen
3、cesaybetargetgenestransactivatedbyC1amongegenescodingproteinsetabolism,tumorimmunityanddevelopment,andinitiationanddevelopmentofliverfibrosis.ThisfindingbroughtsomeneRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与pGEMT
4、easy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选阳性克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果：成功构建人类新基因C1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后挑选40个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段，随机挑选含有插入片段的30个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得18种编码基因.结论：筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生发展及肝脂肪变及肝纤维化发生发展密切相关的蛋白编码基因，推测了C1在体
5、内可能存在的调控机制的线索.【关键词】抑制性消减杂交；反式激活；克隆;乙型肝炎病毒0引言乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）由乙型肝炎病毒C基因的C区编码的一种结构性蛋白，在HBV的生活周期中，HBcAg,病毒mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒，在核心颗粒中完成病毒DNA的合成.HBcAg对于乙肝病毒前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成具有重要作用，还与病毒成熟、识别包膜蛋白以及病毒向细胞外释放等过程密切相关［1］.HBcAg特异性CD4+T细胞免疫应答是清除HBV的重要反应［2］.我们利用酵母
6、双杂交技术对白细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用的蛋白进行研究，发现了一种能与HBcAg结合的未知功能蛋白，将其编码该蛋白的基因命名为C1，GenBank收录AY555145,利用生物信息学技术确定其开放读码框架（ORF），并对其进行了克隆化研究，顺利得到了C1基因编码序列.其编码区为366个核苷酸(nt),编码121个氨基酸残基，我们利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建C1作用于肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的反式调节cDNA消减文库，筛选差异表达的基因片段，并应用生物信息学进行分析，为进一步了解C1的功
7、能及其探讨HBV感染的发病机制提供理论依据.1材料和方法1.1材料HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5α为本室保存，pcDNA3.1（-）真核表达载体购自Invitrogen公司；FuGENE6转染试剂购自Roche公司，mRNAPurification试剂盒购自AmershamPharmaciaBiotech公司，PCRSelectcDNASubtraction试剂盒，50×PCREnzymeMix，AdvantagePCRCloning试剂盒购自Clontech公司，HighPurePCRProductPu
8、rification试剂盒购自BoehringerMannheim公司，T7，SP6通用引物及pGEMTeasy载体购自Promega公司.真核表达质粒pcDNA3.1(-)c1由本室构建.DNA序列测定由上海联合基因公司完成.1.2方法1.2.1真核表达载体的细胞转染及mRNA提取用FuGENE6脂质体转染试剂将2μg的pcDNA3.1(-)c1及pcDNA3.1(-)空载体分别转染
