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1、环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562/A02细胞的多药耐药论文【摘要】目的:探讨环孢菌素A(CsA)、汉防己甲素(Tet)及两者联合应用对人白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药的逆转作用。方法：采用MTT法测定柔红霉素(DNR)对细胞的半数抑制量(IC50),流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内DNR浓度。结果:DNR对K562细胞和K562/A02细胞IC50分别为0.27和21.22mg·L-1;CsA（1mg·L-1）及Tet（0.1mg·L-1）单独和联合处理K562/A02后，
2、DNR的IC50分别为7.83、5.32和2.32mg·L-1;CsA和Tet对DNR作用K562的IC50无明显影响；K562/A02细胞48h凋亡率为2.19%，DNR(1mg·L-1)作用K562/A02细胞凋亡率为2.70%，CsA和Tet单独及联合处理后凋亡率分别为10.27%、17.64%和52.79%；两药处理后细胞内化疗药物DNR浓度亦明显增加。结论:CsA及Tet均可逆转耐药,且联合作用逆转效果更强。【关键词】环孢菌素A;汉防己甲素;K562/A02细胞;多药耐药化疗是目前治疗
3、肿瘤的重要手段之一，而多药耐药(multidrugresistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-gp)介导的MDR是目前肿瘤MDR研究最多的主要机制之一，研究表明，其表达与细胞强大的药物外排能力有关［1］。环孢菌素A(CsA)是一种免疫抑制剂，可调节P-gp的功能,抑制P-gp的过度表达,逆转肿瘤细胞MDR［2］；汉防己甲素(Tetrandrine,Tet)是中药粉防己块根中的主要成分,是一种非特异性的Ca2+通道阻滞剂,研究表明它可以调节多种P-gp介导的MDR细胞株
4、的耐药［3］。两种药物单独应用在体外实验中得到了一定的逆转耐药效果.freelol·L-1阿霉素、10%胎牛血清1640培养液中,于实验前1周停用阿霉素。两种细胞均置于37℃、5%CO2培养箱中，2～3d传代1次。1.2实验器材、药物及试剂LDZ522离心机(北京医用离心机厂),SartoriusBS110S天平(北京赛多利斯天平有限公司),HZ28201K恒温振荡器(太仓市科教器材厂),.freelitalia公司）,CsA(瑞士山德士公司),Tet（江西银涛药业有限公司）,四甲基偶氮唑盐(M
5、TT,Sigma公司,用PBS配制成5g·L-1），胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI1640培养液(GIBCO公司)。1.3方法1.3.1实验分组实验时取对数生长期细胞,细胞密度按不同实验要求进行调整:(1)对照组为K562或K562/A02细胞悬液;(2)DNR组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR；(3)DNR加Tet组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和Tet；(4)DNR加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和CsA；(5)DNR加Tet加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR、
6、Tet和CsA。1.3.2MTT法测定逆转剂对DNR细胞毒性影响参照文献及试剂盒说明进行。取对数生长期的耐药株和敏感株细胞，加入逆转剂(单用或联合,CsA终浓度1mg·L-1,Tet终浓度2.5mg·L-1)作用1h,按所设梯度加入不同浓度DNR,每个浓度设3个复孔。血清培养液为调零孔组,不加药的细胞悬液为空白对照组,接种于96孔板,每孔含2×105个细胞悬液200μl。置于37℃、5%CO2培养箱孵育48h后取出,加MTT反应液20μl,继续培养4h后于平板离心机上3000r·min-1离心1
7、0min,弃上清,每孔加150μl二甲亚砜溶解,微量振荡器混匀,酶标仪上测定540nm波长的吸光度(A)。计算细胞的生长抑制率:生长抑制率(％)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。IC50=细胞生长抑制率为50%时的药物浓度耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50实验重复3次,每次设3个复孔,取平均值为最终结果。1.3.3FCM检测细胞凋亡率取K562/A02细胞,终浓度2×105ml-1,根据实验分组分别加药(单用或联合，DNR终浓度1mg·L-1，CsA终浓度1mg·L-1,Te
8、t终浓度0.1mg·L-1),另设K562/A02对照组和只加DNR（1mg·L-1）的K562/A02细胞对照组,分别孵育48h后收集细胞,用4℃预冷的PBS洗涤两次,用1mlblotbuffer重悬细胞,各加入AnnexinⅤ-FITC10μl,另外设空白对照和FITC对照,常温避光15min,洗涤细胞后在FCM上检测细胞凋亡情况。1.3.4FCM检测细胞内DNR浓度取K562/A02细胞株,终浓度2×105ml-1,分组加药,分别孵育48h,另设K562细胞及不加逆转剂K562/A02细胞
