抑制ras 信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化论文

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1、抑制Ras信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化论文王晓燕刘兵要晖宇侯宁杨晓于晓妉毛宁【摘要】为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞(EmbryonicStemcells,EScells)造血分化的影响，将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞，免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用，应用半定量RTPCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：RasN17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1、SCL及betamajor

2、珠蛋白等基因的表达被显著抑制，而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。【关键词】胚胎干细胞；造血分化；RasSuppressionofRasMediatedSignalingAttenuatesHematopoieticDifferentiationofEmbryonicStemCellsofMiceInVitroAbstractToinvestigatethepossibleinvolvementofRassignalinginthehematopoieticdifferentiati

3、onofembryonicstemcells(EScells),EScellsinantnegativemutantofRas.oreover,theexpressionofseveralmarkersrelatedatopoiesisincludingRunx1,SCLandbetamajorglobin，entofhematopoieticandendotheliallineages,atopoieticdifferentiationofEScells.Keybryonicstemcell;hematopoiesi

4、sdifferentiation;RasRas是由1条多肽链组成的低分子量蛋白，由原癌基因ras编码而命名.freelbryonicstemcell,EScell)是一种具有全能分化特性的细胞，其体外造血分化可以模拟并重现体内胚胎造血过程。报道表明：Ras及其下游的信号通路对ES细胞体外培养过程中全能性的维持非常重要［2］。但Ras蛋白能否调控小鼠ES细胞体外造血分化并不明确。为此，本研究探讨了Ras信号通路阻断对ES细胞造血分化的影响。材料和方法材料DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为H

5、yclone公司产品。硫代甘油（MTG）为Sigma公司产品。丙酮酸钠、无蛋白杂交瘤培养液Ⅱ（PFHMⅡ）购自GibcoBRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）购自Chemicon公司。小鼠干细胞因子（SCF）为PeprotTech公司产品。小鼠将CCE细胞接种于Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下进行维持培养。维持培养体系组成为：DMEM含15%胎牛血清、2mmol/LL谷氨酰胺、0.1mmol/L非必需氨基酸、100μmol/LMTG及mLIF1000U/ml。在造

6、血分化培养前48小时将细胞传代于预分化培养体系，即将维持培养体系内DMEM更换为IMDM，其他成分不变。预分化培养48小时后按常规传代收集细胞并计数，细胞按2×103接种于直径35mm的Petridish，培养体系为：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纤维素、2mmol/LL谷氨酰胺、150μmol/LMTG、1mmol/L的丙酮酸钠、2mmol/LPFHMⅡ、50ng/ml的SCF，培养条件同维持培养。ES细胞的pCMVRasN17及pCMV质粒转染质粒pCMVRasN17购自Clontech公司，pCMV质

7、粒空载体为本室构建并鉴定。传代贴壁培养12小时的ES细胞应用Lipofectamine2000(Invitrogen公司产品)按说明书进行转染。24小时后传代于含neo基因的MEF（neoMEF）之上，并同时加800μg/ml的G418筛选阳性克隆。7天后挑取不同细胞克隆扩增后鉴定外源基因的表达。相关基因的RTPCR检测TRIzoL（Sigma公司产品）提取细胞总RNA，按AMV及ExTaq试剂盒(TaKaRa)说明书进行半定量RTPCR以检测相关基因的表达，即每份样本分别取0.02μg（0.01×），0.2μg（0

8、.1×），2μg（1×）RNA进行逆转录反应，然后取1μl的cDNA进行30循环的PCR。引物序列、退火温度及所扩增基因片段长度见附表。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描电泳条带。ProteinAssayKit)测蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%