抑制ras 信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化

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1、抑制Ras信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化作者：王晓燕　刘兵　要晖宇　侯宁　杨晓　于晓妉　毛宁【摘要】　　为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞(EmbryonicStemcells,EScells)造血分化的影响，将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞，免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用，应用半定量RTPCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：RasN17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Ru

2、nx1、SCL及betamajor珠蛋白等基因的表达被显著抑制，而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。【关键词】胚胎干细胞；造血分化；Ras　　SuppressionofRasMediatedSignalingAttenuatesHematopoieticDifferentiationofEmbryonicStemCellsofMiceInVitroAbstractToinvestigatethepossibleinvolvementofRassignalingin

3、thehematopoieticdifferentiationofembryonicstemcells(EScells),EScellsinantnegativemutantofRas.oreover,theexpressionofseveralmarkersrelatedatopoiesisincludingRunx1,SCLandbetamajorglobin，entofhematopoieticandendotheliallineages,atopoieticdifferentiationofE

4、Scells.Keybryonicstemcell;hematopoiesisdifferentiation;RasRas是由1条多肽链组成的低分子量蛋白，由原癌基因ras编码而命名，包括K，N，H3种类型。Ras的活性取决于其与GTP及GDP的结合，与前者的结合是其活化形式。它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信号通路上游的重要组成成分，并通过参与调控这些信号通路而影响细胞的增殖与分化。最近研究发现，Ras及其下游信号分子均参与调控小鼠的胚胎发育，并且不同类型的Ras对胚胎发育特别是造血发育发

5、挥不同的调控作用［1］。胚胎干细胞(embryonicstemcell,EScell)是一种具有全能分化特性的细胞，其体外造血分化可以模拟并重现体内胚胎造血过程。报道表明：Ras及其下游的信号通路对ES细胞体外培养过程中全能性的维持非常重要［2］。但Ras蛋白能否调控小鼠ES细胞体外造血分化并不明确。为此，本研究探讨了Ras信号通路阻断对ES细胞造血分化的影响。材料和方法材料DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为Hyclone公司产品。硫代甘油（MTG）为Sigma公司产品

6、。丙酮酸钠、无蛋白杂交瘤培养液Ⅱ（PFHMⅡ）购自GibcoBRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）购自Chemicon公司。小鼠干细胞因子（SCF）为PeprotTech公司产品。小鼠将CCE细胞接种于Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下进行维持培养。维持培养体系组成为：DMEM含15%胎牛血清、2mmol/LL谷氨酰胺、0.1mmol/L非必需氨基酸、100μmol/LMTG及mLIF1000U/ml。在造血分化培养前48小时将细胞传代于预分化培养

7、体系，即将维持培养体系内DMEM更换为IMDM，其他成分不变。预分化培养48小时后按常规传代收集细胞并计数，细胞按2×103接种于直径35mm的Petridish，培养体系为：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纤维素、2mmol/LL谷氨酰胺、150μmol/LMTG、1mmol/L的丙酮酸钠、2mmol/LPFHMⅡ、50ng/ml的SCF，培养条件同维持培养。ES细胞的pCMVRasN17及pCMV质粒转染质粒pCMVRasN17购自Clontech公司，pCMV质粒空载体为本室构建并鉴定

8、。传代贴壁培养12小时的ES细胞应用Lipofectamine2000(Invitrogen公司产品)按说明书进行转染。24小时后传代于含neo基因的MEF（neoMEF）之上，并同时加800μg/ml的G418筛选阳性克隆。7天后挑取不同细胞克隆扩增后鉴定外源基因的表达。相关基因的RTPCR检测TRIzoL（Sigma公司产品）提取细胞总RNA，按AMV及ExTaq试剂盒(TaKaRa)说明书进行半定量RTPCR以检测