石蜡块可以做常规pcr

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1、石蜡块可以做常规PCR一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，

2、保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。Goelz氏DNA提取方法的主要步骤.切除多余石错，暴露组织.将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；3.溶于TE9提取液(组织<50mg

3、/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24hＴＥ９提取液的制备500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS500μg/ml蛋白酶ＫpH8.04.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次；6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA7.-70℃放置２－４h8.9000xg离心１h9.沉淀物用70％乙醇洗１次0.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。　　不同类型的基因分析所要求的DNA

4、质量和数量不同。Southern印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos

5、,etal,1990；Smit,etal,1988）、蛋白酶消化法（Impraimetal.1987；Brice,etal.1989）。这些方法不经过酚－氯仿－异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶Ｋ缓冲液中消化４h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且征对性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和与引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对

6、TaqDNA多聚酶的抑制所致。二、影响DNA提取质量的因素1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。B

7、armwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel's运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg，高于新鲜标本（19.4/m

8、m3）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带，说明DNA被完全消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至－20℃过夜。然后再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后6