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1、甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究论文.freeletricmethodandtrypanbluestainingeasurethecellproliferentiationandsurvivalrate.Productionofreactiveoxygenspecies(ROS)ofdrug-treatedcellsonitoredbyafluorescentprobe2’,7’-dichlorodihydrofluorescinfluorescence(DCFH-DA).Morpholog
2、icalchangesassociatedinedbystainingitochondrialtransmembranepotentialindebythedual-emissionpotential-sensitiveprobe5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',.freelidacarbocyanineiodide(JC-1).ResultOxidativestressdecreasedtheactivityofSODinHSCs,increasedthecontentofMDAinHS
3、C-T6.GSinhibitedthecellsproliferationanddecreasedtheiROSlevelsinadosedependentmanner,After24hourstreatmentorphologyicratioandtheincreaseofkidney-shapenuclearcells.Furthermore,GSinducedaconcentrationdecreaseinROSproductionandinmitochondrialmembranepotential.C
4、onclusionGSplayanimportantroleinoxidativestressHSC-T6apoptosisaybecorrecteditochondriaapoptosispathitochondriamembranepotential肝纤维化(hepaticfibrosis,HF)是慢性肝病的共同病理学基础,其中25%～40%最终发展为肝硬化甚至肝癌1。目前认为,肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSC)是HF细胞外基质的主要来源细胞,HSC的活化和功能的改变是HF形成的
5、关键2-3,也是抗纤维化研究的核心。越来越多的实验表明,氧化应激是不同原因引起的HF发生的共同通路。实际上,铁负载、乙醇、四氯化碳和丙型肝炎病毒等引起HF的病因都可通过氧化应激和脂质过氧化途径激活HSC。Iredale等4的实验表明,激活的HSC主要不是通过转化为静止的HSC实现的,也并非引起坏死,因为纤维间隔及其邻近区域没有坏死及炎症的表现,而是凋亡的结果。在急性或慢性肝损伤修复的动物模型中也发现了HSC的凋亡。由激活的HSC分泌的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的表达减少,解除了对胶原酶活性的抑制使胶原降解
6、增加,再加上HSC的减少使细胞外基质的分泌减少,两个原因使细胞外基质降解4-6。那么,有针对性地诱导人HSC发生凋亡为HF的治疗提供了实际目标。本课题建立大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的氧化应激模型,着重研究抗氧化剂甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合用药(GS)能否促使氧化应激的HSC凋亡,并探讨凋亡是否与线粒体凋亡途径有关。1材料与方法1.1试剂及细胞株HSC-T6、Dulbeceo’sModafiedEagle’sMedium(DMEM,Sigma);新生小牛血清(杭州四季青公司);Hoechst33258(S
7、igma);MTT、JC-1和DMSO(Sigma);次氮基三乙酸铁(Fe-NTA,Sigma);其余为国产分析纯试剂。GS由新疆特种植物药资源教育部重点实验室提供。1.2仪器多功能酶标仪(Thermo3001VARIOSKANFLASH);AR-2140型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司制造);CO2培养箱(Forma3110,USA);蔡司荧光倒置显微镜。1.3细胞培养HSC-T6用含10%小牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养。传代后培养8h即可贴壁生长;2d后细胞80%～9
8、0%铺满瓶底,即可再次传代,传至3～4代,用于实验。1.4MTT法测定细胞活力对数生长期的HSC-T6用含10%新生小牛血清的培养液吹打成单细胞悬液,以每孔5×104个细胞接种到96孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱培养24h。细胞贴壁率达到70%后药物处理,继续培养48h。最后每孔加MTT溶液20μL(5mg/mL),孵育4h,终止培养,吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL的二甲
