结核分枝杆菌rd1区ppe68-gst融合蛋白表达质粒的构建及表达论文

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1、结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达论文【摘要】目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达.方法:利用PCR技术从结核杆菌Ｈ37Ｒｖ中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆ｐGEX4T1中,构建重组表达质粒ｐGEX4T1Rv3873并转化E.coliJM109,异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化，SDSPAGE和r63000大小的PPE68/GST融合

2、蛋白,占总菌体的40%.TB)PPE蛋白家族的一员,它可能与结核分枝杆菌抗原变异和逃避免疫机制有关,具有重要的免疫学意义,是一种免疫优势抗原［1］.我们克隆表达并纯化PPE68蛋白,.freelHI,EcoRI,蛋白质分子质量标准均购于晶美公司;T4DNA连接酶购于上海生工生物工程有限公司;质粒微量抽提试剂盒、硝酸纤维膜素滤膜、DAB试剂盒购于西安宝信生物有限公司；胶回收试剂盒、EB（溴化乙锭）,琼脂糖、DAB试剂盒、溶菌酶、丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺、SDS（十二烷基磺酸钠）,二硫苏糖醇

3、（DTT）,异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）均购自成都溶海生物科技有限公司；GST融合蛋白纯化试剂盒购自上海杰美基因公司；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG购自北京中山生物技术有限公司.其余试剂均为国产或进口分装分析纯级产品.1.2方法基因组DNA提取参照文献［2］的方法稍加修改后进行.根据GeneBank中Cole等［3］报道的结核杆菌H37Rv株Rv3873基因序列设计引物.引物序列:P1:5′ATAGGATCCATCACCATGCTGTGGCAC3′;P2:5′TATGAATTCC

4、ATTACGGGAGCTCACCAGT3′.引物P1及P2的5′末端分别引入BamHI和EcoRI酶切位点(用下划线表示).上述引物由上海生工生物工程有限公司合成.Rv3873基因的PCR扩增以结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板,反应条件为：94℃预变性5min;94℃变性1min;59℃复性1min;72℃延伸2min;72℃5min共30个循环;72℃继续延伸5min.反应结束后取5UL扩增产物于8g/L琼脂糖凝胶中电泳检测结果.将PCR产物及载体pGEX4T1用限制性内切酶Bam

5、HI和EcoRI分别进行双酶切后用胶回收试剂盒回收.用T4DNA连接酶将回收后的目的片段与载体在16℃连接过夜.取连接反应物5UL转化感受态大肠杆菌（氯化钙法制备［4］）JM109,取转化菌液200UL涂布于含氨苄青霉素（50mg/L）的LB固体培养基上,37℃培养过夜.随机挑取阳性转化子培养并提取质粒DNA进行酶切及PCR鉴定.将鉴定含有目的基因的重组质粒保种菌液送至宝生物工程有限公司进行测序.挑取含有重组质粒的JM109单菌落37℃振摇培养过夜,以1∶100转种于含有氨苄青霉素(50mg/L)

6、的LB液体培养基中,继续振荡培养至OD600为0.6时,加入IPTG至终浓度1mmol／L,诱导表达4h.同时用JM109菌和含空载体pGEX4T1的JM109菌作对照.取菌液1mL离心,PBS洗涤3次后用PBS重悬菌体,加入溶菌酶（10g/L）至终浓度为10mg/L,室温放置30min,反复冻融,12000r/min离心5min分别取上清和沉淀加入1×SDS上样缓冲液,煮沸5min后，进行SDSPAGE.大量诱导表达蛋白,方法同前,处理菌体分为上清和沉淀,每克沉淀重悬于2mL含8mol/L

7、尿素的0.1mol/LTrisCl(pH8.5)中,室温静置30min,离心,转移上清，以透析法除去蛋白样品中尿素，透析后的样品于-20℃保存［4］.按照GST亲和层析柱所提供的方法纯化融合蛋白.将上述纯化产物和JM109对照菌表达产物进行SDSPAGE后转移至硝酸纤维素膜上,50ｇ/Ｌ脱脂奶粉4℃封闭过夜,加入结核患者血清（1∶100）,37℃孵育过夜,TTBS洗涤3次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1∶500),37℃孵育1h,TTBS洗涤3次,DAB试剂显色.2结果2.1重组质粒

8、pGEX4T1Rv3873的鉴定用ＰＣＲ方法以ＭＴＢＨ37Ｒｖ基因组DNA为模板进行扩增,经8g/L琼脂糖凝胶电泳后,得到约为1125bp的DNA条带,与预计目的基因片段大小相符,而空白对照未扩增出条带（图1）分别用EcoRI和BamHI对重组质粒pGEX4T1Rv3873进行单酶切,均见一约3775bp片段,比空质粒双酶切约大1125bp;用BamHI和EcoRI对重组质粒pGEX4T1Rv3873进行双酶切,见与空质粒和PCR产物等大约4900bp和1125b