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1、细胞因子对HSCT6细胞DCNmRNA表达的影响【摘要】目的:探讨细胞因子对核心蛋白聚糖（D）mRNA表达的调节作用。方法:以HSCT6细胞为研究靶细胞,选择血小板衍生生长因子（PDGF）、IFN、TNFα和IL6,通过RTPCR技术观察这些细胞因子对HSCT6细胞DmRNA表达的影响。结果:IFNγ在108～109U/L浓度能抑制HSCT6细胞增殖和增加DmRNA的表达,而IFNγ在105～106U/L浓度时使细胞DmRNA的表达降低;TNFα在高浓度（50nmol/L）能够使DmRNA表达减少;PDGF在10μg/L和100mL/LF
2、CS培养条件下作用最明显;IL6使HSCT6细胞DmRNA水平下调。结论:IFNγ和TNFα对D核心蛋白基因表达有双重调节作用,这种调节作用发生在转录和转录后水平,PDGF对细胞增殖的调节与D表达抑制相关。【关键词】核心蛋白聚糖（D）TNFαIFNγPDGFIL6众所周知核心蛋白聚糖（decorin,D）具有抗组织纤维化作用,而细胞因子在对抗纤维化的形成机制中表现出重要而复杂的作用［1,2］,细胞因子是否能通过调节D的表达实现对抗肝纤维化的作用？其调节作用如何,国内尚未见报道。我们通过RTPCR技术观察IFNγ、TNFα、血小板衍生生长因
3、子（PDGF）和IL6对HSCT6细胞DmRNA表达的影响,旨在从免疫学角度探索肝纤维化治疗的新途径。 1材料和方法 1.1材料 大鼠肝星形细胞株HSCT6细胞为MountSinai医学院Friedman教授惠赠。RPMI1640培养基购自GibcoBRL公司。rhTNFα、rhIFNγ和rhPDGFBB购自美国RD公司。RNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。PCR扩增仪购自TECHNE公司。紫外凝胶成像分析系统型号VL为法国VILBER公司产品。 1.2方法 1.2.1细胞培养 HSCT6细胞50mL/LCO2、37℃孵箱中培
4、养,RPMI1640含100mL/L热灭活新生牛血清。细胞密度为0.1×106～1×106,每2～3d传代1次,取对数生长期细胞用于实验。 1.2.2细胞处理 取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×108/L,接种于50mL培养瓶,5mL/瓶。18～20h换含10mL/LFCSRPMI1640培养液,继续培养20～24h使细胞静止;分组换液,换含100mL/LFCSRPMI1640培养液,同时加入不同种类、不同浓度的细胞因子,对照组只加培养基不加细胞因子。培养24h后收集细胞并抽提总RNA。 1.2.3总RNA抽提 用德国QIAGEN公司试剂盒抽提,按
5、说明进行操作。将细胞先用冷PBS洗涤、胰蛋白酶消化、收集,然后抽提总RNA。对所得样品RNA经紫外分光光度仪进行浓度及纯度测定,-70℃保存。 1.2.4RTPCR扩增 2μg总RNA加入25μL反转录体系中,42℃1h,94℃3min终止反应。取2.5μL反转录产物加入PCR反应体系中,在PCR仪中进行反应。扩增反应参数如下:94℃30s,60℃30s,72℃50s,35个循环。PCR扩增产物保存于-20℃。 1.2.5结果观察和分析 电泳观察特异性条带并进行PCR相对半定量分析。取RTPCR产物10μL上样于15g/L琼脂糖凝胶（含EB）,7
6、0V电泳30min,用法国VILBER凝胶成像仪对特异性电泳条带进行观察和分析。各样本用同一标本的βactin密度值校正。 2结果 2.1不同血清浓度时DmRNA的转录 在低血清浓度条件下DmRNA转录表达量高于在高血清浓度条件下的转录,以2mL/LFCS转录较高（图1）。 2.2PDGF在不同血清浓度中对DmRNA表达的影响 PDGF在100mL/LFCS条件下与HSCT6细胞作用24h,DmRNA表达明显被抑制,低浓度血清中无明显影响（图1）。 3讨论与肝纤维化发生有关的细胞因子主要是一类由炎症或纤维化部位的有关细胞合成和分泌的,作用
7、于靶细胞特定受体发挥局部生物学效应的因子。国内外资料和本室前期的研究发现,肝纤维化时PDGF等水平及其受体均有不同程度的改变。 IFN可从转录水平抑制成纤维细胞合成胶原,对抗组织纤维化［3,4］。本研究中我们发现,IFNγ在108～109U/L浓度能抑制HSCT6细胞增殖和增加DmRNA的表达,提示IFNγ对DmRNA表达有调节作用,而且促进D表达与其抑制HSC增殖相关;IFNγ在105～106U/L浓度时使细胞DmRNA的表达降低,细胞增殖也有增加的趋势。IFNγ对D表达的调节可能是对细胞增殖的调节机制之一。TNFα对肝纤维化的影响具有双重性
8、：既能促进细胞增殖,又能抑制间质细胞胶原的合成。TN
