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1、核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleicacidtesting,NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。1. NAT在血液筛检中的必要性酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1
2、]。这些危险的主要原因是:病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immunosilentinfection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长,如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地
3、保障血液安全。NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCVRNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的
4、血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。2. NAT检测的技术方法1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的发明,标志着NAT的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性
5、、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RTPCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR(nestedPCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCRELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCRSSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性
6、。若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。而临床诊断和血液筛检是2个不同的应用领域,血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种,即RocheCOBASAmpliScreenHBV/HCV/HIV和HIV1/HCV检测系统,FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检
7、的标准之一:必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率>95%。相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。2.2 转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列
