葛根素在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中的神经保护作用论文

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1、葛根素在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中的神经保护作用论文姜泓,王玲,张义和,刘世平,刘广忠【摘要】目的:建立新生大鼠缺氧缺血脑损伤(HIBD)模型,观察新生鼠缺氧缺血后脑组织一氧化氮(NO)和NO合成酶(NOS)及神经元凋亡的变化及葛根素对HIBD的保护作用及机制.方法:用7日龄SD大鼠制备HIBD模型，治疗组在缺氧缺血（HI）后早期腹腔注射葛根素50mg/kg两次.在HI后不同时间测定脑组织匀浆NO和NOS含量以及神经元凋亡数量.结果:HIBD组在HI后24h脑组织NO，NOS明显高于对照组(P0.05)；HI后6h海马CA1区凋亡细胞增多，24h达高峰；葛根素组24h脑组织NO，NOS较H

2、IBD组相比，显著下降(P0.05)，同时海马CA1区的凋亡细胞数在24h较HIBD组明显减少(P0.05).结论:葛根素可通过抑制NOS的表达，减少NO的过量生成.freelg/kg.②缺氧缺血性脑损伤组(HIBD)：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射等量生理盐水.③假手术对照组：仅作颈部切口，游离右侧颈总动脉，但不结扎，于手术后即刻、4h腹腔注射等量生理盐水.1.2.2新生大鼠HIBD模型的建立以5g/L的氯胺酮麻醉，取仰卧位固定于手术板上.采取颈正中偏右2~3mm切口，游离右侧颈总动脉，用50丝线结扎、缝合切口后，恢复2h置于2000mL常温常压缺氧舱，以1.5L/min的速度输入含

3、80mL/L氧气和920mL/L氮气的混合气体，以测氧仪监控氧的浓度为(80±5)mL/L,2h后取出，返回母鼠身边继续哺乳喂养.1.2.3脑组织标本的留取于脑缺氧缺血后6h,24h分别麻醉后断头取脑并矢状离断为左右半球.1.2.4脑组织匀浆的制备及NO,NOS的检测取部分右脑组织漂洗、去除血渍、称重，按1∶9的比例加入冷生理盐水，在玻璃匀浆管中充分研碎致匀浆化，取100mL/L脑组织匀浆3500r/min离心10min,取上清液检测NO,.freelm，依次脱水、浸蜡、包埋，切片厚度约6μm,HE染色，光镜下观察确定海马位置，临近处的石蜡标本连续切片.切片放入65℃的烤片机上6h，取出

4、后放入4℃冰箱待用.原位缺口末端标记(TUNEL)染色细胞凋亡检测：将组织切片依次脱蜡至水后，进行TUNEL染色，观察400倍光镜5个视野下平均阳性细胞数，具体操作步骤按试剂盒中的说明书进行（选用蛋白酶K通透处理）.统计学处理:数据以x±s表示，两组间比较采用LSDt检验.2结果2.1NO，NOS的变化HIBD在HI后6h脑匀浆NO,NOS水平开始升高，但与对照组相比无统计学意义（P0.05）；24h脑匀浆NO，NOS水平明显增高，与对照组相比差异显著（P0.05）；而葛根素治疗组24h脑匀浆NO，NOS水平显著低于HIBD，两组相比，差异有统计学意义（P0.05,表1）.2.2HE染

5、色和TUNEL染色假手术组在各个时间点脑组织切片无明显缺氧缺血改变.HIBD组6h缺氧缺血侧海马组织轻度水肿，可见神经元肿胀、变性、空泡形成，核固缩，嗜碱性增强，核仁消失，并可见到凋亡小体；24h细胞凋亡达高峰，并见许多坏死细胞，嗜伊红深染（图1）.HIBD组各时间点其缺氧缺血侧细胞核内均可观察到凋亡细胞，凋亡细胞形态学特征为胞体缩小，细胞膜完整，染色质凝集，密度增高，呈块状或颗粒状，胞核中有棕色颗粒.HIBD后6h其阳性细胞开始出现，24h最为明显，呈小片样分布.凋亡细胞多位于病变较重的皮质的边缘内带和海马CA1区；而假手术对照组仅偶见到阳性细胞；葛根素治疗组细胞凋亡的时程与HIBD组

6、一致，分布极其相似，但海马CA1区的凋亡细胞数在24h后各时间点较HIBD组均明显减少（P0.05，表2）.表1新生大鼠各组脑匀浆NO,NOS水平表2新生大鼠不同时间点右侧大脑海马CA1区凋亡细胞数3讨论一氧化氮（NO）和内皮素（ET）是一对由血管内皮细胞分泌的血管舒张和收缩因子，其生物活性相互拮抗［1-2］.NO是一种具有自由基性质的气体生物活性分子,大量研究表明，NO在脑缺氧缺血性损伤中具有神经保护和神经毒性的双重作用，生理状态下，NOS催化LArg和分子氧生成低水平固有型NO，作为内皮源性舒张因子具有舒张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS

7、及iNOS被激活［3］,NO过度合成则可干扰与生物转化有关的酶类的活性、破坏DNA结构、抑制线粒体的呼吸功能，具有明显的神经毒性作用［4-5］.葛根素是从中药葛根中提取的一种异黄酮单体，其化学名为4，7二羟基8D葡萄糖基异黄酮.既往研究表明其具有多种药理作用，包括：改善脑微循环，提高局部血流量，阻止Na+内流，具有Na+通道抑制剂的作用［6］；抑制钾外流［7］；抗氧化［5］；拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，减轻谷氨酸钠、N