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《低剂量顺铂节律化疗抗血管生成作用的实验研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、低剂量顺铂节律化疗抗血管生成作用的实验研究论文牟坤沈方臻肖文静李明君【摘要】目的探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用。方法采用MTT法检测低剂量顺铂节律化疗对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人肝癌细胞株HepG2增殖的影响;采用流式细胞术检测细胞周期观察其对HUVECs、HepG2生长的影响；采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,观察其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果低剂量顺铂（7.5～750.0μg/L）持续作用24、48、72h,对HUVECs具有抑制增殖作用，且在7.5～750.0μg/L范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组,差异有显著意义(F=
2、14.57～285.44，q=3.50～7.63，P0.05),且当顺铂浓度达到750.0μg/L时对内皮细胞HUVECs增殖抑制作用达到饱和。相同条件下,低剂量顺铂对人肝癌细胞株HepG2则未显示出抑制作用,实验组的吸光度值与对照组比较差异无显著意义(F=0.71～1.18，P0.05)。流式细胞仪检测显示低剂量顺铂组处理HUVECs细胞48h后与对照组比较,随顺铂浓度增大，G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增多,其差异有显著性（F=6.44～12.30,q=3.26～8.47,P0.05）；低剂量顺铂组处理HepG2细胞48h后与对照组比较,各期细胞比例无明显改变，差异无显著意
3、义(F=0.03～0.10.freelg/L链霉素的ECM条件培养基常规培养,第4～6代细胞用于实验。HepG2细胞系本实验室常规培养，使用含体积分数0.10FBS、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基常规培养。受精培养基由美国Sciencecell公司生产；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)由兰州民海生物工程公司生产;注射用冻干型顺铂，购自齐鲁制药有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、甲基纤维素系Sigma公司产品；二甲基亚砜(DMSO)由武汉博士德生物工程有限公司提供。1.2实验方法1.2.1细胞增殖抑制试验(MTT法)3收集对数生长期的HUVECs及HepG2细胞，以
4、0.5×104/mL分别接种于96孔培养板,于37℃、含体积分数0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,24h后换入顺铂浓度分别为7.5、75.0、750.0、7500.0μg/L含药培养液,对照组用不含药物的培养液换液,然后移至37℃恒温、含体积分数0.05的CO2饱和湿度培养箱中继续培养，24、48、72h后各取出一块培养板,每孔加入5g/LMTT20μL,继续培养4h后,取出96孔培养板，1000r/min离心5min后,弃孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO,振荡10min,酶标仪测定570nm波长处的吸光度值(A值),细胞存活率=药物实验组A值/细胞对照组A值×100%。1.2.2
5、细胞周期分析收集对数生长期HepG2细胞及HUVECs,以1×109/L细胞浓度10mL接种于100mL培养瓶中,孵育24h。按实验分组分别加入相应药物,继续培养48h后取出各组细胞一瓶,离心,预冷PBS(pH7.40)洗2次。将经PBS洗后的细胞悬液快速注入装有预冷1mL含体积分数0.75乙醇的EP管中,混匀,4℃冰箱过夜。PBS洗2次,将等体积的细胞悬液和碘化丙啶(PI)染液混合,4℃放置30min。混合液过300目尼龙网以除去杂质。将样品放入流式细胞仪测定,所得数据输入Macintish650型计算机,分析细胞周期分布。1.2.3鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长试验4将鸡受精卵在37
6、℃、60%相对湿度恒温箱中孵育至血管生长高峰时(第7天)，在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区域（约胚头右下方0.5～1.0cm处)，划定1cm×1cm开窗位置，在鸡胚气室端钻1mm小孔并穿透壳膜。在蛋壳开窗位置用小砂轮磨切开窗，体积分数0.75乙醇消毒，用橡皮吸头从气室小孔轻轻吸气使绒毛膜下沉，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚尿囊膜。将甲基纤维素薄片放置于尿囊膜毛细血管新生区,用微量进样器将不同浓度的顺铂20μL滴入纤维素薄片上。对照组用生理盐水，滴入量同顺铂组，用消毒薄膜封窗后放人孵化箱，继续孵化。每天追加相同剂量的药物,72h后揭去消毒薄膜，加入适当甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下
7、固定15min。待绒毛尿囊膜血管中的血液凝固后,将薄片周围3cm直径区域内的尿囊膜剪下,光学显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况,计算其抑制百分率。1.3统计学处理实验数据采用SPSS13.0与PPMS1.55统计软件进行处理,统计方法采用方差分析。2结果2.1低剂量顺铂节律化疗对HUVECs和HepG2细胞的抑制作用低剂量顺铂作用HUVECs细胞24、48、72h,结果显示均具有抑制作用,且在一
