原发性乳腺癌组织中klk6蛋白和mrna的表达及其临床病理学意义

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1、原发性乳腺癌组织中KLK6蛋白和mRNA的表达及其临床病理学意义：王守满,毛杰,李波,吴畏,唐利立【摘要】目的:探讨KLK6蛋白及其mRNA在原发性乳腺癌组织中的表达和临床意义。方法:随机选取原发性乳腺癌患者88例并收集其术后标本,采用SABC免疫组化方法和RTPCR技术,检测乳腺癌组织和正常乳腺组织中KLK6蛋白及其mRNA的表达。并分析其与原发性乳腺癌组织临床病理学特征之间的关系。结果:KLK6蛋白在原发性乳腺癌组织中的阳性表达率为78.40%(69/88),并与癌组织的临床病理学特征有关;发生淋巴结转移及E

2、R(+)的癌组织中KLK6蛋白的阳性表达率明显低于未转移组(P<0.05)及ER(-)组(P<0.05)。KLK6mRNA在原发性乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织(P<0.01);但发生淋巴结转移的癌组织中,KLK6mRNA的表达水平明显低于未转移组(P<0.05);ER+组亦低于ER(-)组(P<0.05)。KLK6蛋白及其mRNA的表达与乳腺癌相关基因CerbB2的表达无相关性(P>0.05)。结论:KLK6蛋白及其mRNA的异常表达可能与原发性乳腺癌的发生、浸润

3、、转移有关,可以作为一个肿瘤标志物在临床中应用。【关键词】原发性乳腺癌;临床病理学;KLK6;mRNAKallikreins(KLKs)是一类新发现的、与性激素相关的肿瘤基因家族［1］。KLK6是KLK基因家族的成员之一,其编码的蛋白人组织型激肽释放酶6(humankallikrein6,hK6)是由223个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶,具有胰蛋白酶样活性。研究表明重组的hK6在体外能降解胞外基质蛋白,推测其可能在肿瘤的浸润中起作用,目前KLK6参与肿瘤发生发展的确切机制尚不清楚［2］。原发性乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤

4、,其浸润和转移过程较为复杂,发病机制尚未明确,目前患者的治疗效果不佳［3］。因此,寻找原发性乳腺癌侵袭转移的相关因子,对于指导治疗、提高术后生存率均有十分重要的意义。我们应用免疫组织化学染色技术（SABC法）和逆转录聚合酶联反应（RTPCR）技术,检测KLK6蛋白及其mRNA在正常乳腺组织和原发性乳腺癌组织中的表达,探讨其与原发性乳腺癌临床病理学特征的关系。1材料和方法1.1材料2000-07/2002-07经病理确诊为原发性乳腺癌患者88例,年龄48.9±2.6(26～69)岁,排除原位癌。患者术前均未行化放

5、疗。其中TNMⅠ～Ⅱ期58例,TNMⅢ～Ⅳ期30例。病理类型:浸润性导管癌33例,单纯癌35例,导管内癌11例,黏液腺癌9例。对照组标本20例,为非肿瘤组织中的正常乳腺组织。鼠源性抗人KLK6mAb（工作浓度1∶500,#ABIN188148）和免疫组织化学染色采用SABC法试剂盒均购自上海生工生物技术有限公司。生物素化二抗、辣根酶标记链酶卵白素复合物均购自福州迈新生物技术开发公司。1.2方法1.2.1免疫组化SABC检测采用免疫组织化学染色SABC法。标本依次进行以下处理:多聚甲醛固定,石蜡包埋,4μm连续切片,

6、于70℃烤片15min后,依次进行脱蜡、水化、梯度乙醇脱水,30mL/LH2O2灭活内源酶,PBS漂洗5min×3次。正常山羊血清室温孵育15min。滴加20～30μLPBS稀释的一抗4℃过夜。PBS漂洗5min×3次。生物素化二抗、辣根酶标记链酶卵白素复合物依次在37℃下,孵育45min,PBS漂洗5min×3次。DAB显色5～10min,自来水充分洗涤,苏木素复染5min,稀盐酸淡化30s,冲洗5min。脱水、透明、封片,镜检。设KLK6蛋白表达阳性的结肠癌组织为阳性对照,用PBS替代第一抗体作阴性对照。KLK

7、6蛋白表达阳性为癌细胞的细胞质出现棕黄色颗粒,不出现者为阴性。在400×光镜下观察10个视野,每个视野计数100个细胞,阳性细胞率小于20%为阴性,阳性细胞率大于等于20%为阳性［4,5］（此处的标准设定依据:参照参考文献中的KLK6蛋白在其他种类肿瘤中阳性表达判定的标准;经预实验结果进行进一步确定）。1.2.2RTPCR技术检测TRIzol为Invitrogen公司产品,按操作说明书步骤提取每例标本的总RNA后,在扩增仪上进行RTPCR。根据紫外分光光度计测得各管总RNA质量浓度。当质量浓度在800～1400

8、mg/L时,各取4μL总体积的RNA逆转录成cDNA。逆转录条件:加水至反应体系20μL,42℃1h,70℃变性10min,反应完毕后取出,冰上放置5min,将生成的cDNA置于-20℃保存。分别取一定量的cDNA进行PCR扩增,加引物1μL,模板1.2μL,其余按说明操作。参考cDNA文库,利用PRIMER5.0设计引物序列,所有引物均由上海生工生物技术服