人工转录激活因子激活小鼠内源oct4基因的研究

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1、人工转录激活因子激活小鼠内源Oct4基因的研究第一章文献综述1.1转基因与基因靶向修饰基因组靶向修饰是研究生物分子遗传与进化中的一种新方法，特别是在基因治疗与进化发育研究，基因组靶向修饰技术拥有巨大潜力。通过转基因技术，人们按照意愿，改变生物的遗传密码，获得转基因生物模型。传统的基因修饰是对基因序列进行突变或少量的碱基的插入与缺失，改变原有基因型或者阅读框，是基因不能正常的编码蛋白序列。而现代的基因修饰不仅仅是基因序列进行突变或少量的碱基的插入与缺失，还包括了基因敲除（Geneknock-out）、基因敲入（Genekno

2、ck-in）、基因修复（Geneediting）。还有不改变基因的序列，但对基因表达进行调控：基因甲基化或去甲基化、基因激活、基因抑制等。自从1981年，世界上第一只转基因小鼠的成功培育（PalmiterRDetal.1982），人们开始尝试利用各种途径来对物种的基因组进行修饰、修改，期望改变物种基因的表达，探索基因的功能。在随后的二十多年间，基因组靶向修饰的发展速度极其缓慢。逆转录病毒（JaenischR1983）以及同源重组（CapecchiMR.1989）是这段时间最常用的方法。但是这些传统的方法存在很多的缺陷：逆转

3、录病毒可以整合入物种的基因组中，存在一定的安全隐患，且逆转录病毒的整合位点是随机的，难以检测其整合位点，如果整合入某些看家基因中，可能会影响看家基因的表达，造成基因缺陷病；同源重组法通过长片段的同源臂与基因组进行定点基因重组，但细胞中同源重组的效率很低，一般重组概率为10-6～10-7。由于这些传统方法的局限性，转基因只有部分模式生物如酵母、小鼠、果蝇中实现。转基因技术的发展亟需一种可以靶向修饰基因组的工具。近年，人工靶向核酸酶（Engineeringtargetablenucleases）的出现让转基因物种的生产进入了一

4、个黄金时代（SegalDJandMecklerJF2013）。人工靶向核酸酶一般由DNA结合域和DNA切割域组成。DNA结合域能识别特异的DNA序列，并结合在DNA上；DNA切割域可以在靶位点处切割DNA双链，造成DNA双链断裂（Double-strandBreak,DSB）或DNA单链切口（Nicking）。DNA的损伤会激活细胞内的修复机制：非同源末端连接（Non-homologousendjoining，NHEJ）或同源重组（Homologousrebination，HR）。非同源末端连接修复一般会在DNA双链断裂处

5、造成少数核苷酸的插入或缺失（Indel），造成基因突变，大多数情况会造成阅读框的改变而使得基因功能丧失。当存在同源臂的情况下，DNA双链断裂还能通过同源重组修复：在DNA双链断裂处通过同源重组直接修复DNA或者在DNA双链断裂处引入新的基因。人工靶向核酸酶不仅能提高基因突变的概率，也能大幅增加基因重组的效率（RouetPetal.1994）。1.2类转录激活效应因子（TALE）类转录激活效应因子（Transcriptionactivator-likeeffectors，TALE）是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomona

6、sspp.)中发现的一种跨物种的转录激活因子。黄单胞菌能侵染水稻、甘蓝、柑橘等多数农作物，TALE在侵染过程中起着关键作用。第一个TALE是AvrBs3，首次在辣椒病原菌Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria中发现，可以诱导20个辣椒基因的转录。AvrBs3无任何毒性，但能引起含有抗病基因Bs3辣椒的免疫反应。随后，又在其它黄单胞菌的中发现了超过50个类似AvrBs3的基因，将它们都归为AvrBs3家族，它们有的无毒性，有的可以使病原菌侵染植物引起疾病。研究发现，AvrBs3家族的蛋白高度同

7、源，AvrBs3家族在N端存在一个Ⅲ型分泌信号，随后是一段高度重复的DNA结合序列，接着是核定位信号（NLS），最后是一个酸性的转录激活域。AvrBs3家族的蛋白能结合在宿主基因组上，调控宿主基因的表达，因此将它命名为类转录激活效应因子。2004年，研究人员发现，植物的某些基因发生突变，TALE无法再与DNA结合，从而获得对黄单胞菌的抵抗能力。人们开始注意到TALE独特结构及其与DNA之间的相互作用。.第二章人工TALE转录激活因子的快速构建及激活MEF内源Oct4基因2.1TALE四聚体库的构建传统的TALE组装方法需要

8、大量不同的引物，在扩增过程中可能引入突变；并且连接过程中，可能会因为IIs型内切酶的黏性末端相似而出现错误连接。一旦出现错误，不仅不能得到正确的TALE，而且还无法得知错误的。为了方便TALE的构建，先将单体TALE重复单元的两端插入IIs型内切酶并克隆进载体。通过TALE重复单元载体再利用Golden