环维黄杨星d对大鼠在体回肠的作用及其机制论文

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1、环维黄杨星D对大鼠在体回肠的作用及其机制论文【摘要】目的：探讨中药单体环维黄杨星D（CVBD）对大鼠在体回肠的作用及其机制.方法：经十二指肠插管给予不同浓度的CVBD，观察CVBD对回肠收缩的影响，并分离培养大鼠回肠平滑肌细胞，应用钙敏感的荧光指示剂Fura2,于荧光分光光度计上测定平滑肌细胞内游离钙离子浓度（［Ca2+］i）.结果：给药组在给予CVBD110min以后大鼠回肠的收缩幅度增强，而预先给予钙通道阻滞药硝苯地平可拮抗其对回肠的收缩作用.当回肠平滑肌细胞悬液细胞外钙（［Ca2+］o）为1.5mmol/L时，CVBD可诱发静息期［Ca2+］i升高，而预先给予维拉帕米可以抑

2、制［Ca2+］i的升高，抑制率为17.9%；当［Ca2+］o为零时.freela公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；免疫组化一抗：鼠源aactinmAb,LABVISION公司；免疫组化二抗：SP小鼠通用试剂盒，天津联星试剂公司；即用型SABC免疫组化染色试剂盒：天津联星试剂公司；其余均为国产分析纯试剂.1.2方法1.2.1CVBD对大鼠在体回肠的作用实验分为5组：生理盐水组（4mL/kg）、CVBD高、中、低剂量组（15,5,2mg/kg）、硝苯地平组（2.7mg/kg硝苯地平＋15mg/kgCVBD）,每组8只.大鼠禁食不禁水24h，背部皮下麻醉，仰卧位固定于手术台.开腹暴露

3、十二指肠，向其内插入一橡胶导尿管以备给药；然后将肠系膜较长的一段回肠（约7~8cm）引入营养液浴槽，浴槽定位于恒温水浴缸内，并向浴槽内倒入37℃KH营养液，通以950mL/LO2和50mL/LCO2的混合气体；最后在回肠上选择两点（相距约1.5cm）,一点固定在肠管固定棒的下端,另一点用与微拉力传感器连接的蛙心夹夹住，传感器(负荷2g)与BL410生物机能实验系统连接.1.2.2给药与指标的记录待肠管活动趋于平稳后,各组分别经十二指肠插管给予相应药物.计算各剂量组给药30,60,90,110,.freelin后3min内与给药前3min内回肠收缩幅度均值的比值，分析不同给药组与对照组、硝

4、苯地平组与高剂量CVBD组的差异.1.2.3大鼠回肠平滑肌细胞的分离与培养分离回肠平滑肌细胞参考Pacaud方法加以改进［2］.取大鼠（150g）脱颈椎处死，快速自回盲部上2cm取回肠10cm，置于冰生理盐水中，沿肠系膜将肠段剖开，轻柔洗净.移入含3×105U/L青霉素及链霉素的Dhanks液中浸泡30min，钝性刮去黏膜及浆膜层.将平滑肌层组织剪成1mm×1mm×1mm碎块，于终浓度含胶原酶Ⅰ1.2g/L,链霉蛋白酶E0.2g/L,BSA3g/L的消化液中37℃振荡消化，分次消化、收集细胞（第一次消化后的上清弃去），至组织全部被消化.将各次所得的上清液过100目细胞筛网，离心（800r

5、/min,5min），弃上清，最后以含200mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，细胞长至致密单层即可传代.回肠平滑肌细胞要进行平滑肌肌动蛋白aactin免疫组织化学染色进行鉴定.1.2.4Fura2/AM负载及平滑肌［Ca2+］i的测定将贴壁生长的传代平滑肌细胞消化下来，制备成细胞悬液，加入溶于DMSO的Fura2/AM(终浓度为5μmol/L)，恒温37℃振荡50min.采用日本岛津RF510型荧光分光光度计测定平滑肌细胞［Ca2+］i，因为同一批培养出来的细胞具有同质性，不同剂量组分别设有6组同质的细胞悬液.统计学处理:实验所得数据以x±s表示，统计分析软件为SPSS1

6、3.0.组间均数的比较用单因素方差分析及LSDt检验，P0.05为有统计学差异.2结果2.1大鼠在体回肠实验经十二指肠给予不同浓度CVBD，在不同时间点观察回肠的收缩幅度，经多因素方差分析P0.05，即随着时间延长回肠收缩幅度升高更为显著，并且高、中、低剂量CVBD组之间具有剂量依赖性.结果显示，110min后大鼠回肠的收缩幅度开始升高，给药后130,140,150min收缩幅度则高于对照组.硝苯地平组110min后回肠收缩幅度低于高剂量组（图1）.图1环维黄杨星D(CVBD)作用于大鼠回肠的收缩幅度趋势图2.2回肠平滑肌细胞形态学观察倒置显微镜下,新分离的回肠平滑肌细胞呈长短不一的

7、梭形或椭圆形，核位于细胞中央.图2A为贴壁生长3d的回肠平滑肌细胞，胞质向外伸出长短不一的突起，大多细胞有2~3个突起；图2B为生长14d的平滑肌细胞，呈典型的峰谷样生长形式.免疫细胞化学检测结果显示：平滑肌细胞呈梭形或多角形，胞质内可见棕色及浅棕色细颗粒，呈阳性反应，而核不着色，呈浅蓝色(图2C).可见培养的平滑肌细胞纯度较高，几乎无成纤维细胞混杂.A:培养3d×100;B:培养10d×100;C:免疫组织