同种异体心脏移植急性排斥反应的无创监测论文

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1、同种异体心脏移植急性排斥反应的无创监测论文马涛，胡军，蔡振杰，李彤，王晓武，程亮【摘要】目的:观察同种异体心脏移植术后血清C反应蛋白（CRP）的动态变化，探讨监测其血清浓度水平在评价移植成活质量及判断心脏排斥反应的作用.并研究体外单项混合淋巴细胞培养作为无创心脏移植排斥反应监测方法及意义.方法:26例原位心脏移植患者手术前后及心内膜心肌活检（EMB）时同期监测受体血清CRP浓度水平，依术后30d内受体是否成活分为成活组（n=24）与死亡组（n=2）；依EMB标本（n=32）病理等级（ISHLT）分为阴性组（0.freelixedlymphocyt

2、eculture，MLC）技术进行改良，采取心脏移植受体外周血淋巴细胞体外混合培养以期准确而无创监测心脏移植后急性排斥反应.1对象和方法1.1对象截止20030926我科心脏移植患者26（男21，女5）例，年龄12～68岁，体质量31～86（平均59±14）kg.其中17例为扩张性心肌病，4例为缺血性心肌病，3例为克山病，1例先心病，1例为冠心病搭桥术（CABG）后.心功能（NYHT）III级4例，Ⅳ级22例.术前超声心动图示左室射血分数（EF）0.21～0.42，平均0.31±0.09；术前右心导管检查示肺动脉收缩压（PAP）32～56（平均

3、45±12）mmHg（1mmHg=0.133kPa）；肺小血管阻力1.3～6.33（平均2.95±0.8）MF2g/d(分2次口服)，术中开始体外循环前将甲基强的松龙1000mg加入预充液中，停机后再静脉推注甲基强的松龙500mg.术后采用FK506,MMF（骁悉）和泼尼松三联免疫方法，给予甲基强的松龙5mg/（kg·d），持续1g/(kg·d)，总量每日递减5mg，直至15mg维持半年；FK506用量为0.1～0.33mg/(kg·d)，术后1mo维持血中FK506的谷值在15～25μg/L，3mo后为5～15μg/L；MMF用量为2.0g/d，

4、分2次口服，术后半年减至1.0g/d，分2次口服.术后1mo行心肌内膜活检(endomyocardialbiopsy,EMB)时抽取外周静脉抗凝血，分离外周淋巴细胞.在获取脑死亡心脏移植供体心脏时，同时无菌切取部分供体脾脏，以制备供体淋巴细胞样本.1.2方法1.2.1CRP检查采取受体外周静脉血离心后ELISA法检测，移植前检查1～2次，移植后每天检查1次至1mo，在受体复查及心内膜心肌活检时同期检查.其参考的正常范围0.2～5.0mg/L.1.2.2心内膜心肌活检（endomyocardialbiopsy,EMB)心脏移植后3mo内做活检1～2次

5、，3mo后每隔6mo左右检查一次，怀疑发生排斥反应时随时做.每次活检均在局麻、X线引导下取右心室室间隔处标本，40g/L甲醛固定液固定做病理和2.5g/L戊二醛固定液固定做电镜检查.病理切片石蜡包埋，HE染色，急性心脏排斥反应等级按照ISHLT（InternationalSocietyofHeartandLungTransplantation）1990年分级标准（0～4等级）进行排斥反应分析.1.2.3混合淋巴细胞培养①供体淋巴细胞的制备在RPMI1640培养液中研磨供体脾脏，将细胞悬液离心10min，加入温热氯化铵溶解红细胞，再次离心10min

6、，全部吸取中层灰色细胞层，生理盐水离心清洗2次，台盼蓝染色，计数板计数.调整细胞密度为2×109/L，分成3管，各自离心,每管中加入250μL丝裂霉素（终浓度50mg/L）和1.75mL生理盐水，37℃水浴40min，生理盐水离心洗涤2次.用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640液调整细胞浓度为1×1010/L.-70℃冰箱冻存备用.在进行混合淋巴细胞培养时，37℃水浴解冻，生理盐水洗涤1次，用含120mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×1010/L.标记为D.②受体淋巴细胞的制备新鲜外周静脉血按1∶1比例加在装有比重

7、为1.077的淋巴细胞分离液的离心管中，离心20min，吸取中间雾状淋巴细胞层.生理盐水洗涤2次.用含120mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×1010/L.标记为R.③混合淋巴细胞培养及分组将已制备好的R和D按如下分组加入96孔板，置37℃，50mL/LCO2孵箱中培养24h.A组：R50μL+D50μL；B组：R50μL+D50μL+IL2纯化中和单抗15μL；C组：R50μL+IL2纯化中和单抗15μL；D组：R50μL.每组3个复孔，空白对照组RPMI1640培养液100μL.④酶标分析仪检测培养24h后，每孔

8、加入MTT试剂（5mg/L）15μL，继续37℃，50mL/LCO2孵箱中培养2～4h.离心20min，弃上清，每孔加入D