枸杞基因组dna提取及指纹图谱分析论文

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1、枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析论文严奉坤，许兴，魏玉清，雍立华，郑国保【关键词】枸杞；,,基因组DNA；,,RAPD；,,指纹图谱摘要：目的建立一种适于RAPD分析的快速提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并利用RAPD技术研究枸杞属植物基因组DNA指纹图谱。方法采用改进的CTAB法提取枸杞冷藏幼叶的基因组DNA，利用RAPD技术对其进行指纹图谱分析。结果改进的CTAB法提取的10份枸杞材料基因组DNA均适于RAPD分析；可提供清晰的RAPD指纹图谱，利用筛选出的2个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增.freelicDNAfromLyciumbar

2、arumandItsFingerprintAnalysisAbstract：ObjectiveTodevelopvalidmethodtoextractDNAfromLyciumbararumforRAPDanalysisandresearchitsDNAfingerprintbyusingRAPDtechnology.MethodsTheextractsofhighqualitygenomicDNAthefrozenleavesofLyciumbararumbymodifiedCTABmethodanditsfingerprinticDNAcoul

3、dbegotbyRAPD.Tersamplification.Atotalof56DNAbandsongorphic,theaveragerateofpolymorphicbandsodifiedCTABmethodentationincesiumchloridegradientorcolumnchromatography.TheRAPDmarkerscanbeusedforthestudiesoffingerprintofLyciumbararumsensitively.Keybararum;GenomicDNA；RAPD；FingerprintR

4、APD由PeltierThermalCycler，MJResearch，Inc，USA）；电泳仪（DYY10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪（BIORADLab，Inc，USA）；Eppendorf5415D离心机；UVPGDS8000凝胶成像系统。Buffer，TaqDNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，300bpDNAladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士FlukaChemika公

5、司）。1.3方法1.3.1基因组DNA提取采用CTAB法［12～15］，并适当改进。具体步骤为：①枸杞幼叶在液氮中研磨至无可见组织块后装入1.5ml的Eppendorf管中（大约1/3体积），加入500μl提取缓冲液〔含100mmol/LTrisHCl（pH8.0），20mmol/LEDTA,.freelol/LNaCl，2%CTAB，0.2%β巯基乙醇〕，混匀，65℃温育30min，取出立即放入冰中冷冻10min。②加入500μl的氯仿异戊醇（24∶1），混匀，于4℃冰箱中冷冻10min，12000r/min离心10min，转移上清液于干净的1.5

6、ml的Eppendorf管中，重复1次。③加入300～500μl的异丙醇或1ml的无水乙醇混合，于-20℃下静置20min。12000r/min离心15min，弃上清液，先加入70%乙醇洗沉淀两次去除有机溶剂、无机盐等，然后加入无水乙醇脱水，室温干燥。④将干燥DNA溶解于200μl的ddH2O或TE缓冲液（含10mmol/LTrisHCl，1mmol/LEDTA，pH8.3）做母液于-20℃储存。将DNA母液取出10μl稀释40倍后，用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪测波长260，280及320nm处光吸收，直接从仪器主屏上读出被测样品A

7、260，A280，A260/A280和DNA含量。点6×上样缓冲液10μl于玻璃板上，分别吸取各材料DNA母液2μl与其混匀，然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳（72v电压下电泳30min），检验DNA片段大小。最后将DNA母液稀释为20ng/μl的工作液分装成小包装于-20℃储存或4℃保存备用。1.3.2PCR扩增及电泳检测反应在PTC200型PCR仪上进行。采用本实验室长期使用的20μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8μl25mmolL-1Mg2+，1μl2.5mMdNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1μl0.375μm

8、10碱基随机引物，50ng模板。反应程序：预变性94℃2min；预扩增程序：94℃20s，36℃30s，72