中华眼镜蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌细胞株增殖周期及细胞凋亡的影响论文

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1、中华眼镜蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌细胞株增殖周期及细胞凋亡的影响论文刘成军，韦世秀，李牡艳，吴华，李佳荃【摘要】目的探讨中华眼镜蛇毒（Chinesecobravenom）对体外培养的人类小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞株诱导凋亡的作用。方法应用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感实验法（ATP-TCA）测定细胞的生长抑制百分率，倒置相差显微镜、HE染色观察细胞形态学改变，流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率。结果ATP-TCA实验显示眼镜蛇毒对体外培养的NACC细胞生长有明显的抑制作用，与浓度和作用时间呈正比；形态学观察发现用药后的NACC细胞质空泡、核固缩、核染

2、色质聚集等形态学变化现象；流式细胞仪检测发现眼镜蛇毒阻滞NACC细胞生长于细胞周期的G0／G1期.freel-inducedapoptosisinNoovelHumanpalatalsalivaryglandcellsline.MethodsTheadenosinetriphospate(ATP)-bioluminescencetumorchemosensitivityassay(ATP-TCA)inethegroindifferentconcentration.Cellapoptosisetryandcellmorphology.ResultsTheexper

3、imentshocouldobviouslyinhibitthegroe-dependentmanner.ThechangesinmorphologyofNACCCelletryanalysissho.TheapoptoticratesofNACCcellstreatedgroupscaninhibitproliferationandinduceapoptosisofNACCcells.Key;NACCcell;Cellcycle;Cellapoptosis涎腺腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，研究有效药物控制其复发和转移成为目前研究的热点。中华眼镜蛇毒中成

4、分复杂，其主要成分有神经毒素、细胞毒素、酶、蛋白质及多肽等。具有多方面的药理作用，如抗炎、抗血小板聚集、镇痛、抗肿瘤等。随着蛇毒毒理学、药物学、生物化学和分子生物学的发展，近年来国内外学者越来越重视蛇毒抗肿瘤作用的研究。据报道眼镜蛇毒在体内体外都具有抗肿瘤作用［1～3］。而眼镜蛇毒对NACC细胞株的作用如何，国内外尚未见报道。在本研究中，我们尝试应用近年发展起来的对恶性实体肿瘤有较高可评估率的新方法三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感实验法（ATP-TCA法）［4］，研究眼镜蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞株的抑制作用，测定眼镜蛇毒与癌细胞存活的量效和

5、时效关系，应用HE染色观察眼镜蛇毒作用NACC细胞后细胞形态学的改变，以及流式细胞术检测眼镜蛇毒作用后的NACC细胞凋亡等方面的实验，为眼镜蛇毒的抗肿瘤临床应用提供实验依据。1材料与方法1.1药品与仪器中华眼镜蛇毒冻干粉（广西医科大学蛇毒研究所）；ATP试剂盒［德国DCS公司，包括：完全分析培养基（CAM）、ATP提取液、荧光素-荧光酶、稀释缓冲液、ATP标准品、96孔检测板、针管、过滤器、过滤膜等］;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;青霉素（哈药集团制药总厂）;链霉素(大连美罗大药厂)；RPMI1640培养基(美国Hyclone)。微孔板式自发光分析

6、仪（德国BETHOLD公司）；水套式CO2培养箱（美国FORMA公司）；流式细胞仪（美国BECKMANCOULTER公司）；倒置相差显微镜（德国ZELSS公司）；病理图象分析仪（德国LEICA公司）。1.2细胞株人类小涎腺腺样囊性癌细胞株（广西医科大学口腔医院）。1.3人类小涎腺腺样囊性癌细胞的培养将人类小涎腺腺样囊性癌细胞按常规方法培养于含10%胎牛血清，青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期人类小涎腺腺样囊性癌细胞用0.125%胰酶消化后收集细胞悬液，细胞计数板计算细胞数，加入

7、完全分析培养基（CAM）制成1×105/ml细胞悬液。1.4ATP-TCA法测定人类小涎腺腺样囊性癌细胞增殖的抑制率将眼镜蛇毒冻干粉，用完全分析培养基（CAM）溶解，倍比稀释成100，50，25，12.5，6.25μg/ml的不同浓度蛇毒溶液，每种蛇毒浓度各取100μl分别置96孔板中，每个蛇毒浓度组设4个复孔作为实验组，并设未加蛇毒孔作为对照组。于各孔中加入1×105/ml的细胞悬液100μl，置5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中分别培养24，48，72，96h，然后向各孔中加入ATP提取液50μl，多次吸取混匀，避免产生气泡，室温下孵育5min。从各孔中吸取

8、50μl培养液，置96孔