南药高良姜基因组dna提取方法的研究

《南药高良姜基因组dna提取方法的研究 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、南药高良姜基因组DNA提取方法的研究庞启华，严萍，赵翾，赵树进【摘要】　　目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子鉴定、分子系统分类和分子进化等下游分子生物学研究。方法在CTAB改良法基础上，采用4个方案提取DNA。结果用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，产率为0.54～1.049μg/mg干燥叶片。基因组DNA能被限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ完全酶切，经AFLP分析，得到了条带清晰的DNA指纹图谱。结论用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，符合分子生物学研究要求。【关键词】高良姜；基因组DNA；提取　　Abstra

2、ct:ObjectiveTodevelopamethodtopreparehighqualitygenomicDNAofA.officinarumHancefordomolecubiologicalresearch.MethodsFourprotocolsbasedonmodifiedCTABmethodedtoextractgenomicDNAfromA.officinarumHance.ResultsTheOD260/OD280ratiosofgenomicDNAextractedodifiedCTABmethodrangedfrom1.8to2.0,theyieldsofDNAsamp

3、legdriedleaftissue.DNAsampleses(EcoRⅠandMseⅠ)andplesextractedodifiedCTABmethodareolecubiologicalresearch.　　KeyHance;GenomicDNA;Extraction　　高良姜AlpiniaofficinarumHance是姜科山姜属植物，在中国主要分布于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜干燥的根茎是著名的十大南药之一，有一千多年药用历史，据《中国药典》记载，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的功效〔1〕，研究表明高良姜还有广泛的药理作用〔2〕

4、，在香料生产和水果保鲜上也有应用〔3，4〕。长期的采挖和生态环境破坏，导致高良姜野生资源骤减，目前主要通过无性繁殖的方式进行人工栽培。近年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和欧美，价格呈上升趋势，利益的驱动导致了混淆品和伪品的出现，影响了治疗效果，扰乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标记技术建立高良姜的DNA指纹图谱，以及进行高良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子鉴定和质量控制，以及高良姜种质资源保护和开发提供科学依据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是进行下一步研究的前提条件。植物含有丰富的次生代谢物，这些化合物的存在干扰

5、了基因组DNA的提取，不同的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取方法有所不同，主要有CTAB法和SDS法两种基本方法，并在此基础上进行改良以适合不同的植物〔5～7〕。本研究根据常规的CTAB法〔8〕进行改良，比较了4个方案提取高良姜基因组DNA的效果，其中，方案4提取效果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于下游的分子生物学研究。　　1材料与方法　　1.1试剂和溶液CTAB，PVP-40，Tris为Genviea分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产分析纯，EcoRⅠ和MseⅠ为NEB产品，λHindⅢmarker和DL2000marker为Takara产品。清洗缓冲液

6、：200mmol/LTris-HCl(pH8.0)；50mmol/LEDTA；250mmol/LNaCl；2%PVP-40(odel200/210Poinator凝胶成像仪。　　1.3材料试验材料采自广东的广州、深圳和徐闻、海南万宁、广西南宁、云南西双版纳等地，经过中国科学院华南植物研究所邢福武教授鉴定为植物高良姜（A.officinarumHance）。采摘高良姜顶端嫩叶，剪为约2cm长的小段，放入装有干燥硅胶的密封袋中进行快速干燥，硅胶与叶子的体积比大约为10∶1，硅胶吸水变色时要更换硅胶，干燥叶片保存在密封的塑料袋中置于-20℃保存。　　1.4提取DNA的步骤　　1.4.1称取50mg

7、左右的干燥叶片，剪碎后放入研钵中添加液氮研磨成粉末状，迅速转移到2ml的离心管中。　　1.4.2加入800μl65℃预热的CTAB提取缓冲液和20μlβ-巯基乙醇混匀，置65℃水浴1h（每隔10min颠倒G1次使溶液混匀），待溶液冷却置室温。　　1.4.3加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），充分颠倒混匀5min，12000r/min离心10min，用剪去尖端的1ml吸头小心吸取DNA水相转入另一2ml离心管