叶酸检测方法研究进展

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1、叶酸检测方法研究进展　　1942年，Stokstad首次成功地合成了叶酸，并阐明了叶酸的化学结构。半个世纪过去了，叶酸一直是学术界的研究热点。目前的研究证实，妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是神经管畸形发生的重要病因之一〔1〕。叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，对预防心血管疾病的发生具有重要的生物学意义〔2〕。　　叶酸是一组化学结构相似，生化特性相近的化合物统称，是由喋啶、对氨基苯甲酸和1个或多个谷氨酸结合而成。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸

2、(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu)后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。　　叶酸以8种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。用于评价人体叶酸营养状况最常用的检测指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。目前，叶酸的检测方法已有多种，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最为广泛。　　一、微生物法　　微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法，通常所用

3、的微生物有干酪样乳酸杆菌（L.casei)、粪链球菌和啤酒小球菌属。此3种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)，可用于鉴别分析各种形式叶酸在不同检测物的分布。L.casei对单谷氨酸叶酸、含2或3个谷氨酸叶酸(PteGlu2、PteGlu3)及其还原型衍生物均敏感，是3种微生物中反应谱带最宽的一种，也是最为常用的菌种。它对含7个谷氨酸叶酸(PteGlu7)的敏感度很小，约为对PteGlu敏感度的1％，故有人认为L.casei对超过3个谷氨酸基团的多谷氨酸叶酸无响应

4、。但有研究发现，L.casei对PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6和PteGlu7的敏感度分别为对PteGlu的65.6％、19.9％、3.5％及2.4％，同时对某些形式的多谷氨酸叶酸的敏感度随培养时间的延长而增加，其机理有两种可能：其一，微生物在培养过程中合成水解酶，随培养时间延长，水解酶产量增加，促使部分长链谷氨酸水解断裂；其二，细菌在培养过程中细胞壁对多谷氨酸叶酸的通透性增加。所以，尽管L.casei对叶酸的反应谱带较宽，但如检测物中含有多谷氨酸叶酸须将样品在检测前加入多谷氨酸叶酸水解酶进行水解，使各种形式叶酸均转变成单谷氨酸

5、叶酸，否则检测结果不能代表其叶酸总含量。　　传统的微生物学检测方法是试管法，操作繁杂。1987年，Nean和Tsai〔3〕在进行食物叶酸分析过程中，对传统的方法做了改良，将96孔酶标板和全自动酶标板读数仪(酶标仪)引进方法中，大大减少了试剂的消耗，缩短了加样及人工读取检测结果的时间。如使用在对数生长期冷冻保存的L.casei菌种或／及对抗生素耐药菌株，还可使检测方法进一步简化。另有研究证实〔4〕，使用对数生长期L.casei菌种(ATCC7469)可使检测物培养时间从36～48小时减至18小时。O＇Broin和Kelleher〔5〕用L.cas

6、ei氯霉素耐药株(NCIB10463)对血清及红细胞叶酸进行检测，结果与传统的微生物法检测结果呈显著线性相关(r值分别为0.975和0.96)。使用氯霉素耐药株，可以省略试剂过滤消毒及无菌操作等步骤。　　尽管微生物法灵敏度高，结果准确，但也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响等。用β-乳酰胺酶处理样品后，可消除青霉素和先锋霉素等抗生素对叶酸检测结果的干扰〔5〕。　　微生物法除可用于检测血清和全血叶酸外，还可用于检测纸血片叶酸〔6〕，检测结果为叶酸与血红蛋白的比值。由于纸血片标本制

7、备技术简单，纸血片叶酸稳定性较好，故该法对大规模人群叶酸营养状况的流行病学调查具有重要的意义。　　二、同位素放射免疫法　　尽管微生物法得到各种改进，但仍因耗时大，操作复杂而不能得到广泛使用。70年代初，有学者提出同位素放射免疫法检测血清叶酸。该方法具有快速、简便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。　　放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶

8、酸含量。但微生物法对所有单谷氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值