溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜nfκb p65蛋白表达及血清tnfα含量的影响论文

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1、溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜NFκBp65蛋白表达及血清TNFα含量的影响论文【摘要】观察溃结灵对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠粘膜核因子κB（NFκB）p65蛋白表达及血清肿瘤坏死因子α（TNFα）的影响。【方法】将SD大鼠60只随机分为6组，即正常组，模型组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组（剂量为0.5g·kg-1·d-1），溃结灵高、中、低剂量组（剂量分别为18.3、9.2、4.6g·kg-1·d-1）。除正常组外，其他各组均采用三硝基苯磺酸（TNBS，100mg·kg-1)复制UC模型；采用酶联免疫（ELISA）法检测血清样

2、本中TNFα的含量；处死动物，取结肠组织固定.freela公司生产；A5002型酶标仪由Tecan公司生产。1.4模型复制［6］采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法复制UC大鼠模型。取3月龄SD大鼠60只，造模前禁食24h，留取10只作为正常组，其他大鼠乙醚麻醉，用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度为8cm，推入100mg·kg-1TNBS溶液，捏紧肛门平放5min，术后常规饲养。1.5给药方法造模后第3天，造模动物分为模型组，溃结灵低、中、高剂量组，以及阳性对照SASP组，每组各10只，分别按设计剂量给药，模型组及正常组给予等容积蒸馏水，每天

3、1次，均连续10d。1.6标本处理治疗结束后，大鼠禁食24h，在乙醚麻醉下眼眶采血3mL，4℃冰箱中静置3h，然后3000r/min离心15min，吸出血清另管存放于-20℃冰箱中备用。采血后处死大鼠，选择结肠病变最严重的部位剪取2cm，放入体积分数为10%中性缓冲福尔马林溶液中固定。1.7免疫组化染色按常规包埋，切片，厚度4μm。按试剂盒操作说明进行免疫组化染色。在光镜下，细胞浆和细胞核内出现棕黄色颗粒的细胞为NFκBp65阳性细胞。在40倍高倍镜下选取典型视野计数1000个细胞，其中阳性细胞数作为NFκBp65计数值，并以百分率表示。

4、1.8TNFα含量检测按试剂盒说明书进行操作，每孔加样量为100μL，终止反应后用酶标仪在492nm处测吸光度（D）值。所有D值均减除空白值后再进行计算。以标准品1000、500、250、125、62、31、16、0pg/mL之D值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品D值在该曲线上查出相应TNFα含量。1.9统计学分析采用SPSS11.0软件进行统计分析。2结果2.1溃结灵对UC大鼠结肠粘膜组织NFκBp65蛋白表达的影响表1结果表明：模型组肠粘膜组织NFκBp65蛋白阳性细胞表达率显著性高于正常组(P＜0.01)，溃结灵中、高剂

5、量组及SASP组阳性细胞率则显著性低于模型组(P＜0.01)。图1结果显示：正常组腺体排列整齐，有少量棕黄色着色细胞（NFκBp65阳性反应细胞）；模型组腺体排列紊乱，有大量棕黄色着色细胞；溃结灵低剂量组腺体排列较整齐，阳性细胞较多；溃结灵中剂量组腺体排列较整齐，有一些阳性细胞；溃结灵高剂量及SASP组腺体排列整齐，阳性细胞较少出现。表1溃结灵对UC大鼠肠粘膜NFκBp65蛋白表2溃结灵对UC大鼠血清TNFα含量的影响表2结果表明，模型组血清中TNFα含量显著性升高（P＜0.01），溃结灵中、高剂量组及SASP组血清中TNFα含量则

6、显著性低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。3讨论细胞因子在UC发病中的作用已得到公认，TNFα在多种细胞因子免疫网络中居重要地位，是目前已知的与炎症性肠病（IBD）发病关系最为密切的细胞因子。TNFα主要通过使中性粒细胞聚集、内皮粘附分子上调、凝血酶原效应等参与UC的发?Ｔ贗BD患者的血、粪便和肠组织中TNF水平均有所增加［7］。近年来抗TNFα单克隆抗体的应用已广泛开展，显示出较好的治疗效果。如Chey等［8］对16名UC难治病人使用Infliximab后，88%的病人临床症状、结肠镜及组织学得到改善。近年研究认为NFκB的活

7、化与细胞因子的调控关系密切。NFκB家族由5个成员构成，根据其跨域激活能力分为2组，第1组具有转录活性的有RelA(p65)、RelB和cRel，第2组不具有转录活性的有NFκB1（p50）和NFκB(p52），其中RelA(p65)具有显著的促炎活性［9］。NFκB广泛存在于各种组织中，能与许多细胞基因的启动子和增强子中的κB转录序列位发生特异性结合，参与包括IBD在内的多种炎症性疾病的发病，UC患者核内NFκBDNA结合活性明显升高［10-11］。对IBD起主要致病作用的细胞因子，如TNFα、IL1β、IL6、IL8等

8、的转录水平由NFκB调控［12］。UC患者的NFκB已被活化并进入核内，具有很强的与基因κB位点相结合的能力，是细胞因子转录及释放的前提和关键。而且绝大多数细胞