溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜nfκb p6

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1、溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜NFκBp6【摘要】观察溃结灵对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠粘膜核因子κB（NFκB）p65蛋白表达及血清肿瘤坏死因子α（TNFα）的影响。【方法】将SD大鼠60只随机分为6组，即正常组，模型组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组（剂量为0.5g·kg-1·d-1），溃结灵高、中、低剂量组（剂量分别为18.3、9.2、4.6g·kg-1·d-1）。除正常组外，其他各组均采用三硝基苯磺酸（TNBS，100mg·kg-1)复制UC模型；采用酶联免疫（ELISA）法检测血清样本中TNFα的含量；处死动物，取结肠组织固定，组织切片进

2、行免疫组织化学染色，光镜下计数NFκBp65阳性细胞表达率，并进行统计学分析。【结果】溃结灵高、中剂量组血清TNFα含量及结肠粘膜NFκBp65蛋白阳性细胞表达率显著性低于模型组（均P＜0.01）。【结论】溃结灵可降低大鼠结肠粘膜NFκBp65蛋白表达及血清TNFα的含量，这可能是其治疗UC作用的机理之一。【关键词】溃结灵/药理学溃疡性结肠炎/中药疗法肠粘膜/病理学疾病模型动物大鼠溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)又称非特异性溃疡性结肠炎,是炎症性肠病（IBD）的一种，近年来国内报告日渐增多［1］。UC的发病机制目前尚不清楚，但

3、肿瘤坏死因子α（TNFα）是公认的能介导UC发病的细胞因子之一［2］，而核因子κB（NFκB）在IBD的病理生理过程中可能起到枢纽作用［3］。研究表明：NFκB调控着UC患者细胞因子的释放，细胞因子包括TNFα刺激能导致NFκB的活化［4］。NFκB最常见的形式是由p50与p65亚基组成的异二聚体，p65亚单位是主要的促炎单位。脾胃研究所在多年临床实践的基础上，以清热健脾活血为治则，总结出溃结灵用于治疗UC的中药复方，临床及实验研究表明该治则对UC有较好的治疗效果［5］。在前期工作基础上，本研究观察了溃结灵对UC大鼠结肠粘膜NFκBp65蛋白

4、表达和血清TNFα含量的影响，以期对溃结灵治疗UC作用的机制进行探讨。现将结果报道如下。1材料与方法1.1动物SD大鼠，SPF级，雄性，体质量180～220g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005A010。1.2药物溃结灵（主要由水蛭、救必应、白芍、炙甘草等组成）药材购于采芝林连锁药店，经广州中医药大学中药学院中药标本中心张秋镇老师鉴定，所购药材均符合中华人民共和国药典标准，按组方比例称取药材，常规方法制备水煎液。大鼠低、中、高剂量按成人用量的5、10、20倍给药，即4.6、9.2、18.3g·kg-1·d-1；维柳芬（柳氮磺胺吡啶，SA

5、SP）为上海三维制药有限公司产品，批号：200410001，大鼠按成人用量10倍给药，即0.5g·kg-1·d-1。1.3主要试剂与仪器兔抗大鼠NFkappaBp65单克隆抗体由美国NeoMakers公司生产，批号：9034P501D；免疫组化试剂盒由晶美生物工程有限公司生产，批号：DEC022005；乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复液（pH9.0，50倍浓缩液，用蒸馏水稀释后使用），由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号：501101；大鼠TNFα酶联免疫双抗体夹心（ABCELISA）试剂盒，由上海森雄科技实业有限公司进口分装，批号：0507170；S

6、FC18型生物显微镜由厦门麦克奥迪公司生产；3K30Z型高速冷冻离心机由Sigma公司生产；A5002型酶标仪由Tecan公司生产。1.4模型复制［6］采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法复制UC大鼠模型。取3月龄SD大鼠60只，造模前禁食24h，留取10只作为正常组，其他大鼠乙醚麻醉，用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度为8cm，推入100mg·kg-1TNBS溶液，捏紧肛门平放5min，术后常规饲养。1.5给药方法造模后第3天，造模动物分为模型组，溃结灵低、中、高剂量组，以及阳性对照SASP组，每组各10只，分别按设计剂量给药，模型组及正常组给予等容积蒸馏

7、水，每天1次，均连续10d。1.6标本处理治疗结束后，大鼠禁食24h，在乙醚麻醉下眼眶采血3mL，4℃冰箱中静置3h，然后3000r/min离心15min，吸出血清另管存放于-20℃冰箱中备用。采血后处死大鼠，选择结肠病变最严重的部位剪取2cm，放入体积分数为10%中性缓冲福尔马林溶液中固定。1.7免疫组化染色按常规包埋，切片，厚度4μm。按试剂盒操作说明进行免疫组化染色。在光镜下，细胞浆和细胞核内出现棕黄色颗粒的细胞为NFκBp65阳性细胞。在40倍高倍镜下选取典型视野计数1000个细胞，其中阳性细胞数作为NFκBp65计数值，并以百分率表示。1.8TN

8、Fα含量检测按试剂盒说明书进行操作，