氧化苦参碱减轻大鼠肝纤维化的机制研究

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1、氧化苦参碱减轻大鼠肝纤维化的机制研究　[摘要]目的探讨氧化苦参碱（oxymatrine，OM）减轻四氯化碳诱导肝纤维化（hepaticfibrosis，HF）的机制。方法建立四氯化碳诱导的大鼠HF模型，制备氧化苦参碱脂质体（Oxymatrineliposomes，OM-liposome）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-Glycin-Asparticacid，RGD）三肽序列偶联的OM及异硫氰酸荧光素（fluorescentisothiocyanate，FITC）标记的OM-liposome和RGD-OM-liposome。分离HF大鼠的肝脏星状细胞（hepaticstella

2、tecells，HSCs）并体外培养：①将OM-liposome、RGD-OM-liposome和RGD偶联的空白脂质体（RGD-liposome）作用于HSCs，利用透射电镜检测HSCs的细胞亚显微结构（凋亡小体）变化，利用流式细胞技术检测HSCs的细胞周期，利用台盼蓝染色检测HSCs的细胞活性。②将FITC-OM-liposome和FITC-RGD-OM-liposome作用于HSCs，利用荧光显微镜技术比较两种剂型OM在HSCs中的分布。结果①与RGD-liposome比较，OM-liposome可促进HSCs凋亡小体形成，增加HSCs凋亡，降低HSCs的细胞活性；与OM-lipos

3、ome比较，RGD-OM-liposome可进一步增加HSCs内凋亡小体，促进HSCs凋亡，降低HSCs活性。②RGD可促进OM-liposome在HSCs内的分布。结论OM-liposome可在体外诱导HSCs凋亡，RGD可促进OM-liposome在HSCs的分布，进一步促进HSCs的凋亡。诱导HSCs凋亡可能是OM减轻肝纤维化的重要机制。　　[关键词]氧化苦参碱；脂质体；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；肝纤维化；肝星状细胞　　氧化苦参碱（oxymatrine，OM）是从传统中药豆根槐属植物苦参或豆科植物苦豆子、山根豆中提取的主要活性成分，是一种四环喹嗪啶类生物碱。近年来研究发现，氧化苦参碱

4、对乙型肝炎、丙型肝炎、肝纤维化（hepaticfibrosis，HF）及肝癌都具有较好的疗效[1]，作用机制目前尚不清楚。各种慢性肝损伤均可发展至HF，目前认为HF是对创伤的一个修复过程，在此损伤修复的反应中，细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）、肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSCs）和细胞因子共同参与发挥了纤维化的作用[2]。越来越多的研究证实，HSCs的活化、增殖在HF的形成和发展过程中起着重要作用，抑制HSCs的活化及诱导HSCs的凋亡对有效控制肝纤维化起到至关重要的作用。研究证实，OM对其他器官组织损伤、纤维化[3]及肿瘤都有一定的

5、治疗效果，其中，OM抑制细胞凋亡是其减轻胰腺癌的重要机制[4]。因此，笔者猜测OM抑制HSCs活化、诱导HSCs凋亡可能是其治疗HF的重要机制，现将研究报道如下：　　1材料与方法　　1.1实验动物与试剂　　清洁级SD大鼠，体质量约200g（第四军医大学），大豆卵磷脂（天津远航化学品有限公司），胆固醇（北京奥博星生物技术责任有限公司），甲醇（西安化学试剂厂），氯仿（西安化学试剂厂），98.9%氧化苦参碱（西安大河药业有限责任公司），异硫氰酸荧光素（FITC，陕西博微生物试剂公司），精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列（陕西博微生物试剂公司），碘化丙啶（PI，陕西博微

6、生物试剂公司），胶原酶Ⅳ（美国Sigma公司），密度梯度离心介质Nycodenz（美国Sigma公司），DMEM培养液（美国Gibco公司），小牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司）。　　1.2方法　　1.2.1制备氧化苦参碱脂质体（逆相蒸发法）将大豆卵磷脂5.0g、胆固醇2.5g，溶于50mL氯仿-甲醇混合液中，70℃水浴挥干溶剂，加入油酸0.5g，聚山梨酯2.5g，搅拌融化。另将氧化苦参碱1.5g、聚乙烯吡咯烷酮2.5g溶于pH7.4磷酸缓冲液中，水浴加热至70℃。将两者混合，恒温搅拌，灌装，密封，超声乳化，所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸除有机溶剂，然后再进行短时超

7、声，即得乳白色氧化苦参碱脂质体（Oxymatrineliposomes，OM-liposome）。　　1.2.2制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸偶联的氧化苦参碱脂质体按10∶1摩尔比加入RGD，室温震荡过夜，得到RGD修饰的氧化苦参碱脂质体（RGD-OM-liposome），冰浴下旋涡震荡30min，通过凝胶柱（CL-4B），层析法除去未偶连的脂质体。　　1.2.3制备RGD偶联的脂质体按照“1.2.1”中的方法制备脂质体（