汉滩病毒s基因5端311bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析论文

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1、汉滩病毒S基因5端311bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析论文.freelAb，以r3.6×104融合蛋白反应，而与核蛋白氨基端Mr2.6×104片段反应的5株mAb（1A8，A35，8E8，3A9，3G11）都能与Mr3.6×104融合蛋白反应.结论汉滩病毒核蛋白氨基端Mr1.0×104以内存在一个或几个线性表位.freelAb与该蛋白的结合.Keyinoproximalofhantaanvirusnucleoprotein.METHODSr3.6×104fusionprotein.Then，e

2、thodsusingthenucleoproteinspecificmAbs.RESULTSr2.6×104regioncouldreactorelinearepitopesintheaminoproximalMr1.0×104regionofhantaanvirusnucleoprotein，andthecarboxy-proximalregionperhapsplaysasignificantroleinmaintainingthethree-dimensionalconstructionsofnuc

3、leoproteinandin-fluencingthebinationofintegratednucleoproteinAbsensionalepitopes.0引言肾综合征出血热（HFRS）是一种由汉坦病毒引起的烈性传染病，严重威胁着人类健康.汉坦病毒目前可分为不同的型别，在我国流行的主要是I型（汉滩病毒）和II型（汉城病毒）.目前对汉滩病毒S基因及其编码的核蛋白（NP）的序列已经清楚，但其在病毒感染及刺激机体免疫应答中的作用尚未完全阐明.本室前期研究已证明汉滩病毒NP氨基端结构（aa1-274，Mr

4、2.6×104）对维持该NP的免疫原性及其与单克隆抗体（mAb）的反应性具有重要作用［1-3］.在上述工作基础上，我们进一步对汉滩病毒76～118株NP氨基端约100位氨基酸的肽段进行了表达和纯化，并用不同特性的mAb对其进行了抗原位点分析，以期更清楚地了解汉滩病毒NP的免疫学特性，为HFRS基因工程疫苗的研制提供实验依据.1材料和方法1.1汉滩病毒S基因5’端311bp片段原核表达载体的构建含有汉滩病毒S基因5’端700bp的pGEM-7zf克隆（pGEM-7zf-HantaanS700）为本室构建并保

5、存.pGEX4T-1原核表达载体及DNA纯化试剂盒购自Pharmacia公司.质粒提取DNA纯化试剂盒购自Promega公司，PCR试剂盒购自Takara公司.EcoRI，SalI，XhoI，DraI等限制性内切酶购自Gibco公司.载体构建过程如下:①以EcoRI+DraI双酶切pGEM-7zf-HantaanS700bp载体，15gL-1琼脂糖电泳回收纯化311bp片段;②以SalI单切pGEX4T-1空载体，10gL-1琼脂糖电泳回收纯化片段;③PCR补平pGEX-4T-1，条件为片段15μL，4×

6、dNTP1μL，Taq酶0.5μL，MgCl21.5μL，10×buffer2μL，72℃，10min;④抽提PCR产物，再以EcoRI酶切，10gL-1低溶点琼脂糖电泳回收;⑤14℃～16℃连接过夜;⑥电穿孔转化连接产物，挑单菌落鉴定（pGEX4T-1-HantaanS300）.1.2汉滩病毒S基因5’端311bp片段的原核表达及纯化将pGEX4T-1-HantaanS300（XL1-Blue）过夜菌种按1100转接至4000mL含100mgL-1氨苄青霉素的2×YTA培养液中，37℃剧烈振荡至A590

7、nm值约为0.6时，留下诱导前对照样本2mL后，加入IPTG至终浓度为0.1mmolL-1，继续摇至A590nm约为1.0后，取诱导后样本2mL.将诱导前后的样本离心集菌，吸净残液后，重悬到100μLPBS中（pH7.4），加入1μL溶菌酶（100gL-1），颠倒混匀，室温下孵育5min，干冰20s/温水1min反复冻融10次，12000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE，观察目的蛋白的可溶性及是否形成包涵体.将4000mL诱导菌液离心集菌，吸弃残液后重悬于200mL1×PBS中，加入Trito

8、nX-100和溶菌酶各2mL，间断温和超声至清亮，然后采用Pharmacia公司的BulkGSTPurificationModule的亲和层析柱法纯化目的蛋白（即汉滩病毒NP片段与GST的融合蛋白）.1.3mAb抗汉滩病毒mAb1A8，3A9，8E8，3G11为本室制备，mAbA35为陈伯权教授惠赠，具有中和活性［4］.上述mAb均可与汉滩病毒NP及其氨基端Mr2.6×104片段反应［1，2］.3C12为本室制备的抗GSTmA