酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的k562细胞的作用

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1、酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的K562细胞的作用【摘要】本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）和p15基因克隆联合作用对K562细胞的增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。用RTPCR扩增p15基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，确认序列正确后构建p15pcDNA3.1载体，将p15pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入p15基因突变的K562细胞，经筛选得到G418抗性的K562细胞株；用TT法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果表明：从对照K562细胞中扩增的DN

2、A片段，在第174-180位点有7个碱基缺失，这证实对照K562细胞中p15基因部位基因缺失。表达外源性P15蛋白的p15pcDNA3.1K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株；流式细胞术显示G0/G1期细胞增多，S期细胞明显减少；p15pcDNA3.1K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升，MTT法显示细胞存活率较对照细胞明显下降。结论：表达外源P15蛋白联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。【关键词】p15基因氨酸激酶抑制剂伊马替尼K562细胞E

3、ffectofTyrosinekinaseInhibitoronp15GeneTransfectedK562CellsAbstractTheobjectiveofstudyatinib）andp15geneontheproliferation,cellcycleandapoptosisofchronicmyeloidleukemiacelllineK562.p15geneplifiedfromperipheralbloodmononuclearcellsbyRTPCR,andconfirmedbyDNA

4、sequencing,thentherebinantp15pcDNA3.1vectorinedbyMTT,cellcycleandapoptosisetry.Theresultsshoatinib,andcellsurvivalratenotablydeclined.Itisconcludedthattheimatinibinbinationotionofitsapoptosis.Keyatinib;K562cellp15基因是细胞周期蛋白激酶抑制剂家族中重要的一员,被认为具有抑癌基因样作用〔1〕，其在多

5、种白血病中存在突变及甲基化失活〔2〕是导致白血病发病的重要原因之一。它与慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）急性变的关系是目前研究的热点。一种酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）对P210BCRABL蛋白激酶具有高度特异的抑制作用〔3〕，对CML具有良好的治疗效果，但它有着耐药、停药后复发以及对急变期细胞疗效差等诸多问题〔4，5〕，联合治疗是CML急变期研究的一个发展方向。将p15基因克隆与伊马替尼联合应用于CML有可能发挥更理想的治疗作用。药物伊马替尼（瑞典N

6、ovartis公司赠送，商品名格列卫），用三蒸水配制成1.00mmol/L溶液，过滤除菌。中国实验血液学杂志JExpHematol2007;15(1)酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的K562细胞的作用细胞培养K562细胞（属于慢性粒细胞白血病急性变成红白血病的细胞株，含bcrabl融合基因，表达P210蛋白）按常规方法在含100ml/L的小牛血清的RPMI1640培养液中，于5%CO2孵箱中培养。菌种和质粒pcDNA3.1真核克隆表达质粒购自美国Invitrogen公司，E.coliJM109菌种由第四

7、军医大学生化教研室提供。试剂限制性内切酶EcoRI和HindⅢ、TaqDNA聚合酶、T4连接酶、逆转录酶等工具酶分别购自宝泰克、上海生工生物工程公司，TRIzoLRNA提取试剂、DNA纯化试剂购自Invitrogen公司，p15鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠二抗购自Santacruz公司，G418购自华舜公司。引物设计与合成P15上游引物：5＇GTAAGCTTATGGCCACGTCTCTGGATTTTA3＇；下游引物：5＇TGGAATTCTTAACTACTAGACCAATCTTGA3＇，上下游分别加入Hi

8、ndⅢ和EcoRI酶切位点，引物由上海生工生物工程公司合成。RTPCR用TRIzoL从外周血单个核细胞提取总RNA，反转录成cDNA后进行PCR，由cDNA0.2μg、10mmol/L的dNTP0.5μl、引物10pmol、TaqDNA聚合酶1U组成的反应体系25μl，94℃45秒、55℃40秒、72℃1分钟，30个循环，最后延伸30分钟，产物经1%琼脂糖电泳，EB染色后在紫外反射投射仪扫描成像。PCR产物胶回