技术方法名称 逆转录合成 cdna

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1、技术方法名称逆转录合成cDNA基本原理以RNA为模扳，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA。与基因组DNA不同，cDNA不包含内含子。图1.逆转录合成cDNA的原理图用途1.从RNA水平对基因的表达进行检测或定量；2.5'和3'RACE，克隆全长基因。实验材料1.耗材离心管（规格：0.5ml）、Tip（规格：0.2ml）。要求无RNase和DNase污染。处理方法一般来说，未开封的进口离心管或Tip均无RNase和DNase污染。但为了慎重起见，需要重新处理。处理程序如下：洗涤饭盒、烧杯和量筒，使之干净干

2、烤，250℃4h，或180℃8h以上。干烤时，量筒和烧杯口均需要用铝箔纸量筒量取无菌去离子水（最好是新鲜制备的水），在烧杯中配制含0.1%DEPC的水溶液，配制时要求混匀，因为DEPC难溶于水DEPC水溶液加到干烤过的饭盒中，一般需要1.2L，投入适量的离心管和Tip，并尽量使它们均浸泡在水溶液中37℃过夜尽可能地倒去浸泡液，注意不要开盖，以避免RNase的污染高压蒸气灭菌，15lbf/in2,（1.034×105Pa），20min烘干，100℃2h置于干净的环境，备用2.试剂Oligo(dT)12-18，或随机引

3、物，或基因特异性引物（GSP）10mMdNTPMix逆转录缓冲液0.1MDTTRNase抑制剂无菌去离子水所有试剂均要求无DNase和RNase污染。基因特异性引物一般由博亚、生工等国内公司合成，PAGE纯化，并用无DNase和RNase的无菌去离子水溶解。Oligo(dT)12-18或随机引物、dNTPMix、逆转录酶（一般同时带有逆转录缓冲液和DTT）、RNase抑制剂为进口试剂，生产公司有Promega、Invitrogen等。3.特殊设备自动微量移液器PCR仪实验设计混合适量的RNA、逆转录引物和dNTP，

4、热变性后迅速冷却，以破坏RNA的二级结构。之后加入其它成分，置于合适的温度下反应。反应完成后，热变性，以灭活可能的DNase，水解DNA复合物中的RNA。因单链DNA不如双链DNA稳定，-20℃下保存的时间一般不超过3个月。严格来说，应该设立阴性对照和阳性对照。阴性对照为省略RNA，其它保持不变。而阳性对照则相对复杂。操作步骤及每步需注意的事项（以SuperScriptTMIIRNaseH-ReverseTranscriptase为例）1.混合逆转录引物、RNA、dNTP1uloligo(dT)12-18(500u

5、g/ml)，或50-250ng随机引物，或2pmole基因特异性引物1ngto5ug总RNA或1-500ngmRNA1ul10mMdNTPMix（10mMeachdATP,dGTP,dCTPanddTTPatneutralpH）加无DNase和RNase的去离子水补足至12ul1.热变性热变性，65℃5min（目的：破坏RNA的二级结构。一般来说，单链RNA分子能自发形成二级结构，二级结构的比例约为50%）。迅速置于冰上（目的：避免已变性的RNA分子复性）。2.加入其它反应成分4ul5×First-StrandBu

6、ffer2ul0.1MDTT1ulRNaseOUTTMRecombinatRibonucleaseInhibitor(40units/ul)（当RNA量不超过50ng时，RNaseOUTTM是必需的。）3.逆转录反应Ø轻轻地上下吸打混匀后，42℃2min（目的：避免逆转录引物与RNA非特异性退火）Ø加入1ul(200units)SuperScriptTMIIRNaseH—ReverseTranscriptase，轻轻地上下吸打混匀。若使用随机引物引导逆转录反应，需25℃孵育10min。Ø42℃50min4.终止反应

7、70℃15min5.保存100℃5min（两个目的：1.灭活逆转录酶和可能含有的DNase；2.水解DNA复合物中的RNA）-20℃保存（单链DNA不如双链DNA稳定，一般不超过3个月）结果观察及分析的原则总cpm掺入cDNAcpm主要的指标有cDNA的产量和质量。cDNA的产量测定：在合成cDNA时，一般掺入α-32P-dCTP，pg=×合成DNA的总量。通常合成率不太高，产量最高可达模扳mRNA的50%。cDNA质量的测定：采用放射自显影技术，简单地描述，在合成cDNA时，一般掺入α-32P-dCTP（或dAT

8、P）。1%琼脂糖凝胶电泳后，进行放射自显影。cDNA长度应为0.7-8kb。实验成功或失败的关键因素1.分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol