兽医免疫学-精品医学ppt课件

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教学安排课堂教学6学时实验教学2学时主要参考书1）刘玉斌等：动物免疫学实验技术，吉林科学技术出版社。2）陶义训等：临床免疫学检验，上海科学技术出版社。返回 绪论一、免疫及免疫学的概念二、免疫学发展历史三、免疫的基本特性和基本功能四、动物免疫学在畜牧业中的应用 一、免疫及免疫学的概念（一）免疫的概念1、古典免疫：免疫一词最早来自拉丁文Immunis，意思是免除兵役、免除赋税。免疫学Immunology来自该词。2、传统免疫：指有机体免除传染病感染、抵抗传染病的能力。3、现代免疫：免疫是有机体识别自身（自身组织）和非自身（非自身物质），并保持自身完整性的生物生理学反应。 (二)免疫学的概念免疫学是研究有机体如何识别和排斥“非已”抗原物质的一门科学。动物在长期进化过程中，形成了一套完整的组织器官结构，称为免疫系统，具有精确的识别自身和非自身的能力。对自身组织不发生任何反应，称为天然免疫耐受现象，对非自身物质（外来侵入者：微生物、寄生虫、有害理化因素、致癌物质等；内部破坏者：衰老破损细胞、突变细胞）进行排除和消灭。 二、免疫学发展历史（一）经验时期（二）实验时期（三）近代免疫学时期（四）现代免疫学时期 （一）经验时期时间：十一世纪＿＿1798年主要事件：1、十一世纪我国的“痘症防御法”。分为时苗和熟苗。2、1400年，我国甘肃牧区的“灌花”预防牛瘟。 （二）实验时期时间：1798年＿＿1945年主要事件：1、1798年Jenner（秦纳）：天花疫苗的由来及效果的研究。2、疫苗研究：1881－1885Pasteur(巴斯德）用鸡霍乱陈旧培养物、炭疽高温培养物、狂犬病兔体传代毒，首创弱毒疫苗。1886Salmon首创灭活疫苗。1888类毒素研制成功。3、免疫技术：相继建立凝集实验（1896，GruberandDurham)、沉淀实验（1897，Kraus）、补体结合反应（1900,BordetandGengou）。4、免疫机理：细胞免疫学说－研究白细胞、吞噬细胞。体液免疫学说－研究抗体、补体。 （三）近代免疫学时期时间：1945年－1960年。主要事件：1、发现了Ⅳ型变态反应。2、发现了免疫耐受现象。3、建立了抗体生成的细胞系选择学说。4、发现了法氏囊的免疫功能。5、建立了更多的免疫学技术：间接血凝实验、凝胶扩散实验、免疫标记技术。 （四）现代免疫学时期时间：1960年－现在主要事件：1、60年代：发现了胸腺的免疫功能；淋巴细胞分成了TC、BC两大类；研究了抗体分子的结构和分类；分析了抗体分子的氨基酸序列。2、70年代：TC分成了不同的亚类；提出了免疫网络学说。3、80年代：抗体多样性的遗传控制；证明了TC表面有抗原受体；单克隆抗体技术；基因工程疫苗。 三、免疫的基本特性和基本功能（一）免疫的基本特性1、识别特性：精确地识别自身和非自身物质。2、特异性：某种抗原物质剌激机体所产生的免疫力，只针对相应的抗原物质。3、记忆性：某种抗原物质剌激机体而使机体的免疫系统产生免疫记忆，相同抗原物质再次进入时，将其更快速、更有效地消灭和排除。 （二）免疫的基本功能1、抗感染：机体抗感染的功能是通过三个环节发挥作用的。（1）阻止病原微生物进入体内。（2）抑制病原微生物在体内繁殖。（3）消灭在体内繁殖的病原微生物。*:抗感染功能过高，引起传染性变态反应；抗感染功能过低，反复发生传染病。2、自身稳定：清除机体正常代谢过程中产生的衰老、破损细胞，保持自身环境稳定。该功能失调，则引起自身免疫病。3、免疫监视：清除机体正常代谢过程中产生的突变细胞。该功能失调，则引起肿瘤和癌症。 四、动物免疫学在畜牧业中的应用（一）免疫预防：应用各种疫苗预防畜禽传染病、寄生虫病等。（二）免疫治疗：应用高免血清、高免卵黄抗体、干扰素等紧急治疗畜禽疫病。（三）免疫诊断：应用各种免疫学诊断技术，诊断和检测畜禽传染病、寄生虫病及其它学科领域（如早期妊娠诊断、血型鉴定等)。 第一章　非特异性免疫概念和特点第一节　防御屏障第二节　吞噬细胞与吞噬作用第三节K细胞和NK细胞第四节　补体系统第五节　正常体液中杀微生物物质第六节　影响非特异性免疫的因素第七节　增强非特异性免疫的方法 非特异性免疫的概念和特点一、概念：动物在长期的进化过程中，在同外来侵入者、内部破坏者的斗争中所建立的、对多种异物都能发挥防御作用的免疫力，称为非特异性免疫。二、特点：1、作用发生迅速。2、作用范围广、不具特异性。3、受遗传控制，很稳定。4、作用强度弱，对毒力强、数量大的微生物作用小。 第一节　防御屏障一、皮肤粘膜屏障（一）作用：阻止病原微生物进入机体内。但个别微生物（布氏杆菌、鼻疽杆菌等）例外。（二）作用机理1、皮肤解质层的机械阻挡作用。2、正常皮肤粘膜上正常菌群的拮抗作用。3、特殊结构（鼻毛、气管纤毛、粘液）的机械排除作用。4、胃液、唾液、乳汁、泪液中乳酸、溶菌酶的抑菌和杀菌作用。 二、血脑屏障（一）作用保护大脑、免除血液中病原微生物对大脑的侵袭作用。（二）作用机理由大脑毛细血管紧密排列的内皮细胞层通过胞饮作用，吞噬和消灭异物的。 三、胎盘屏障（一）作用阻止母体病原微生物进入胎儿，对胎儿保护作用。但个别微生物（布氏杆菌、沙门氏菌）例外。（二）作用机理母体子宫内膜、胎儿绒毛尿囊膜组成屏障结构，阻止病原微生物人母体进入胎儿。 第二节　吞噬细胞与吞噬作用一、概念二、吞噬细胞的来源、分化和特点三、吞噬细胞的结构及吞噬消毁异物的过程四、吞噬细胞的作用 一、概念动物体内专门负责吞噬作用、发挥防卫功能的一群细胞，统称为吞噬细胞。包括血液中的嗜中性粒细胞、单核细胞和组织中的巨噬细胞。 二、吞噬细胞的来源、分化和特点（一）吞噬细胞的来源均来自骨髓多能干细胞。（二）分化 （三）吞噬细胞的特点1、具有强大的吞噬能力（1）嗜中性粒细胞：吞噬能力强，但寿命短，血液中存活几小时。（2）单核细胞和巨噬细胞：吞噬能力相对较弱，但寿命长。2、具有识别能力：对自身物质不起反应，只吞噬和消毁非自身物质。3、细胞内含各种消化酶类，对异物能彻底的消化降解。4、细胞膜表面有IgGFc段受体和补体C3受体。 三、吞噬细胞的结构细胞内有两种颗粒：初级颗粒和次级颗粒，二者统称为溶酶体。1、初级颗粒：细胞发育早期形成，颗粒大，数量少，均匀、致密，含过氧化物酶、溶菌酶类、水解酶类。2、次级颗粒：细胞发育后期形成，颗粒　小，数量多，含溶菌酶、吞噬细胞杀菌素等。 三、吞噬消毁异物的过程细胞膜吸附异物并纳入细胞内，溶酶体与其结合成吞噬溶酶体，由溶酶体释放各种酶类将异物消化降解。 四、吞噬细胞的作用（一）对异物的吞噬作用吞噬细胞对异物吞噬的最终结果，因机体免疫力、病原微生物毒力、数量的不同而不同。1、完全吞噬2、不完全吞噬 （二）传递抗原信息吞噬异物→消化→分解→获得抗原决定簇→结合巨噬细胞的RNA→形成复合物(超抗原)→携带有超抗原的巨噬细胞与TC、BC相遇而将抗原信息传递给TC、BC。所以，特异性免疫不能离开非特异性免疫而单独发挥作用。 （三）调节抗原量原理:抗原量合适，才能刺激机体产生特异性免疫反应。抗原量过小，不足以刺激TC、BC产生免疫反应。此时，吞噬细胞将抗原集中，从而调节抗原量。抗原量过大，使TC、BC产生免疫麻痹，不能引起免疫反应。此时，吞噬细胞大量消毁和贮存抗原，少释放。 第三节K细胞和NK细胞一、来源骨髓多能干细胞淋巴样干细胞胸腺　直接分化法氏囊TCKC、NKCBC （一）Kc特点及作用（killcell）1、细胞特点和数量形态上不易与T、B细胞相区别，都属于小淋巴细胞，但与T、B细胞的表面标志不同，功能不同。约占体内淋巴细胞10％。2、作用主要以ADCC效应杀伤大的细胞性抗原，如寄生虫、肿瘤细胞。杀伤力强。3、ADCC效应又称抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。即细胞性抗原先与特异性抗体结合成抗原抗体复合物，暴露IgGFc段，与Kc的IgGFc受体结合，从而捕获细胞抗原，并缩短Kc与细胞抗原的距离，最终将细胞抗原杀伤。 （二）NK细胞特点及作用(naturalkillcell)1、细胞特点和数量占体内淋巴细胞数不超过10%。无T、B细胞的表面标志，故又称为无标志细胞。与Kc的区别在于对细胞抗原的杀伤作用完全是非特异性的，即不依赖特异抗体就具有杀伤作用，故又称自发的细胞介导的细胞毒作用（SpontaneousCellMediatedCytotoxicity,简称SCMC）。2、作用主要杀伤肿瘤细胞，但杀伤力比Kc弱。由于不依赖抗体，故可在早期发挥作用，补充Kc的不足。 第二章　特异性免疫第一节　特异性免疫的概念与特点第二节　特异性免疫的组织结构第三节　抗原第四节　特异性免疫应答第五节　抗体第六节　变态反应返回 第一节　特异性免疫的概念与特点一、概念机体在生活过程中接触某种抗原物质产生一系列免疫应答连锁反应，从而对该抗原物质再次进入反应强烈，并大大加强对该抗原物质的排斥和清除的过程，称特异性免疫。 二、特异性免疫的特点（1）后天获得，又称后天免疫；（2）具有特异性；（3）具有一定的免疫期；（4）不具遗传性，不能传递给后代，但与动物进化有关。动物越高级，特异性免疫越完善。 第二节　特异性免疫的组织结构一、中央免疫器官（primaryimmuneorgans）（一）骨髓（bonemarrow）（二）胸腺(thymus)（三）法氏囊（bursaofFabricius）二、周围免疫器官（secondaryimmuneorgans）（一）脾脏（spleen）（二）淋巴结（lymphnode）三、免疫活性细胞 第三节　抗原一、抗原的概念二、构成抗原的条件三、抗原的分类四、抗原的交叉性五、佐剂 一、抗原的概念抗原的概念：凡能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质，称为抗原。抗原的性质：凡是抗原，均具有两个性质：（1）免疫原性：抗原物质进入有机体，能刺激机体的免疫系统，产生免疫反应，称为抗原的免疫原性。（2）免疫反应性：能同其刺激有机体产生的—抗体、致敏淋巴细胞发生特异性结合反应，称抗原的特异反应性。 二、构成抗原的条件（一）构成抗原免疫原性的条件1、异物性2、大分子物质3、具有特定结构（二）构成抗原特异反应性的条件 （一）构成抗原免疫原性的条件1、异物性：异物即指机体外来物质，只有外来异物才能刺激机体产生免疫反应，异物程度越高，免疫原性越强。（1）异种物质：如异种动物的血清，各种病原微生物及其产物，如外毒素。（2）同种异体抗原：如人红细胞血型抗原不同，故不同血型的人不能输血。人体内还存在一种有核抗原，叫组织相溶性抗原，在器官移植时，发生移植排斥反应。 （一）构成抗原免疫原性的条件2、必须是大分子物质：分子量越大，免疫原性越强，分子量10000以上为强抗原，5000~10000为弱抗原，5000以下不具抗原性。如牛血清白蛋白为70000，丙种球蛋白为160000，均是强抗原。而胰岛素是5700，为弱抗原。因分子量大的物质具两个特点：（a）表面具较多的化学活性基团。（b）进入有机体后，不易为有机体分解，保存时间长，有更多的机会同免疫系统的细胞成分接触，而激发免疫反应。 （一）构成抗原免疫原性的条件3、具有特定的结构：“抗原决定簇”和“载体”（1）抗原决定簇：在抗原内部和表面有很多化学活性基团，这些化学活性基团称为抗原决定簇。（2）载体：载体是抗原决定簇所依赖的基本结构，起稳定抗原决定簇、激活巨噬细胞及免疫记忆作用。 抗原决定簇特性1、进入有机体后，能刺激有机体产生免疫反应；2、能同其相应的抗体，致敏淋巴细胞发生特异性结合。所以抗原的免疫原性和特异性都是有抗原决定簇的结构和组成决定的。但单独的抗原决定簇因其分子量太小，仍不具免疫原性，只有抗原决定簇与载体结合成大分子物质，才具免疫原性。3、抗原中的抗原决定簇只有存在于抗原表面的才具免疫原性和特异性，下面的实验证明了这个特性：多聚丙氨酸——多聚赖氨酸复合物分子量在10000以上，但无抗原性，若在其表面接上谷氨酸、酪氨酸后，具有了免疫原性，而接在其内部时，无免疫原性，上面实验同时说明，抗原抗体是表面结合的，不稳定的，可逆的。4、如果抗原由于某种原因的影响，内部抗原决定簇暴露于表面，也就具有了免疫原性。 （二）构成抗原特异反应性的条件抗原的特异反应性是免疫反应的基础，是由抗原决定簇的种类和数量决定的。在抗原的表面和内部一般存在一种或几种抗原决定簇，有几种抗原决定簇，进入机体后，就能刺激机体产生几种不同的特异性抗体。抗原决定簇性质不稳定，易受酸、碱、日光、温度的影响而发生结构改变，结构改变了的抗原决定簇使机体产生另一种抗体，失去抗原的原来特异性。临床应用疫苗预防时，常发生无效，可能与抗原决定簇发生了改变有关。 三、抗原的分类（一）根据抗原的性质和结构分类1完全抗原：既具有免疫原性，又具有特异反应性的抗原。如各种微生物及其毒素、异种动物血清。2半抗原：只具有特异反应性，不具免疫原性的抗原。如多糖、类脂、药物等，但半抗原与载体蛋白质结合后具有了免疫原性，则转变成完全抗原，半抗原根据特异反应性是否出现可见反应分：（1）复合半抗原：与抗体结合出现可见反应的半抗原。这种复合抗原具有两个以上的抗原决定簇，与抗体的结合价为多价，如细胞表面的多糖。（2）简单半抗原：与抗体结合不出现可见反应的半抗原。这种简单半抗原只有一个抗原决定簇，与抗体的结合价为单价，如青霉素。这种简单半抗原可抑制抗体与相应的完全抗原或复合半抗原结合，不再出现可见反应，故又称阻抑半抗原。 三、抗原的分类（二）根据其刺激机体产生抗体是否需Tc协同分：1、T细胞依赖性抗原：又称胸腺依赖性抗原，这种抗原需要Tc协同才能刺激B细胞活化，大多数抗原均属此类。2、非Tc依赖性抗原：又称非胸腺依赖性抗原，这种抗原可直接刺激B细胞，使之活化，而不需Tc协同，如大肠杆菌脂多糖。 四、抗原的交叉性不同抗原物质之间可能出现不同程度的交叉反应，称为抗原的交叉性。原因在于：（一）不同物质存在共同的抗原组成：如不同株大肠杆菌常具有K88、K99抗原。（二）不同抗原分子存在共同的抗原决定簇：如沙门氏菌属的A、B、D三群沙门氏菌除各具其特异的抗原决定簇外，决定簇12为三群所共有。（三）不同决定簇间部分构型相同：因蛋白质Ag的抗原决定簇主要决定于多肽末端的氨基酸组成，如末端氨基酸相似，则可出现交叉反应，交叉反应强度与相似程度成正比。 重要的天然抗原（一）微生物抗原1.细菌抗原（荚膜、外膜蛋白、O、K、H、外毒素、内毒素、代谢产物等）：0抗原、H抗原、K抗原、类属抗原、特异性抗原。外毒素、内毒素2.病毒抗原（VP、H、N、F、VIA）V抗原：囊膜纤突，有型和亚型特异性，如流感病毒的血凝素-H、神经氨酸酶-N。P抗原：核衣壳抗原VIA抗原：病毒感染相关抗原，只存在于感染动物的血清中。F融合蛋白抗原3.其他如真菌抗原、原虫抗原和蠕虫抗原，但免疫原性弱，特异性不强，交叉反应多。 （二）高等生物的抗原1.动物血清与组织抗原：常与过敏反应有关2.各种酶：3.激素：蛋白类激素，有免疫原性；脂溶性激素，无免疫原性八、人工抗原1.合成抗原2.结合抗原：非蛋白性质的激素，可以用人工的方法结合在载体上，从而获得该激素的抗血清，能用于免疫检测。 五、佐剂（一）概念：同抗原一起或预先注射到机体，能增强抗原免疫原性或改变免疫反应类型的物质，称佐剂。 （二）佐剂的作用1、将无抗原性的物质转变为有效的抗原。2、增加循环抗体滴度，使之产生更有效的免疫保护性。3、改变循环抗体类型。4、形成细胞参与的变态反应。 （三）佐剂的种类1、Freund佐剂：即弗氏佐剂。分为弗氏不完全佐剂和完全弗氏佐剂。前者是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温80）混合的油乳剂，抗原与之混合形成油包水乳剂。后者是在弗氏不完全佐剂中加入死的分枝杆菌（如结核杆菌或卡介苗）而成。后者的免疫增强作用大于前者，二者均引起注射局部肉芽肿和持久的溃疡，因此只适于实验动物，制备高免血清用，不适宜家畜预防用疫苗。2、氢氧化铝佐剂：常用于死菌苗，增强其免疫原性。3、明矾：同氢氧化铝4、佐剂65：有花生油、单硬脂酸铝和甘露醇单油酸脂组成，是一种安全，有前途的新型佐剂。 第四节　特异性免疫应答一、细胞免疫应答二、体液免疫应答三、免疫反应的相互关系 一、细胞免疫应答（一）概念：Tc接受抗原刺激后产生的免疫反应，称为细胞免疫应答。细胞内寄生菌、立克次氏体、肿瘤，则多以细胞免疫为主。（二）细胞免疫过程（三）细胞免疫的主要作用 （二）细胞免疫过程1、感应阶段2、反应阶段（reactivestage）3、效应阶段（effectivestage） T细胞的表面标志TCR(T细胞抗原受体)：所有T细胞表面具有识别和结合特异性抗原的分子结构。TCR识别抗原的MHC限制性：TCR识别和结合抗原的性质是有条件的，即只有当抗原片段或决定簇与抗原递呈细胞上的MHC分子结合在一起时，T细胞的TCR才能识别或结合MHCII类分子(或I类分子)与抗原片段复合物中的抗原部分。 抗原递呈细胞（APC）是指能摄取、加工和处理抗原，并将处理后的抗原肽递呈给淋巴细胞而使淋巴细胞活化的一类免疫细胞。一类是带有MHCII类分子的细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、朗罕氏细胞，主要进行外源性抗原递呈，抗原肽被递呈给CD4+T细胞识别。另一类是带有MHCI类分子的细胞，包括所有的有核细胞，血小板，网织红细胞等，可作为内源性感染的递呈细胞。内源性抗原被加工、处理，并被递呈给CD8+T细胞。 1、感应阶段指Tc接受抗原信息的阶段。需要巨噬细胞对抗原的加工和传递，在血液中进行。过程：巨噬细胞吞噬抗原，多数抗原被消化分解，失去抗原性，少数抗原的抗原决定簇与巨噬细胞的MHC形成抗原决定簇——MHC复合物，称超抗原，具有更强的免疫原性。因这种复合物常浓集于巨噬细胞表面，保护了抗原决定簇不被分解，从而更有效地为Tc所识别，形成超抗原的巨噬细胞能吸引Tc，并通过细胞表面接触将抗原信息传递给Tc，此乃Tc活化的第一信号。巨噬细胞产生的淋巴细胞活化因子（LAF）作为Tc活化的第二信号，Tc在此双信号系统的刺激下，成为致敏淋巴细胞，进入反应阶段。 2、反应阶段（reactivestage）致敏淋巴细胞转化为淋巴母细胞，一部分转化为效应Tc（包括Tk、Th、Ts），一部分转化为记忆细胞，前者进入效应阶段，后者不再继续分化，存在于机体中保持记忆，其寿命为数月或数年。当相同抗原再次进入后，发挥更强的免疫作用，很快就转化为效应淋巴细胞。 3、效应阶段（effectivestage）即细胞免疫发挥免疫作用的阶段，在血液中进行。（1）效应Tc的杀伤作用：又称细胞毒作用，主要是Tk的作用。首先识别携带有特异性抗原的靶细胞，并于其周围活动，但不能对靶细胞发挥杀伤作用，只有在Th的辅助下，才能对靶细胞攻击，并粘附于其上，破坏其细胞膜，膜受损伤，Na入K出，随后水大量进入，从而改变靶细胞内渗透压，靶细胞破裂。但Tk细胞并未损伤，脱落下来，继续对其它靶细胞发挥作用。由于靶细胞破裂，其内的特异性抗原（如胞内寄生菌）暴露，为致敏淋巴因子进一步杀伤提供条件。 （2）淋巴因子的作用于效应淋巴细胞早期形成，并贮存于其内，当受到同种抗原的刺激时，才从胞内释放出来，由于其产量较低，且不管有无抗原存在，释放的淋巴因子立即作用于周围各种靶细胞。随着被细胞吸附及体液稀释，其活性难以持久，不易抵达远离组织，故认为淋巴因子主要在局部免疫中起显著作用。由于其研究只有十多年的历史，且在体外进行，故其命名也是根据体外作用进行的。 A、作用于巨噬细胞的淋巴因子a、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）：主要是抑制巨噬细胞的移动，使之停留在抗原性异物所在部位，发挥更大的吞噬作用。b、巨噬细胞趋化因子（MCF）：作用是吸引巨噬细胞至反应部位。c、巨噬细胞激活因子（MAF）：增强巨噬细胞的吞噬销毁能力。d、巨噬细胞武装因子（SMAF）：使巨噬细胞获得特异性吞噬抗原性异物和杀伤靶细胞的能力。这个因子是在研究肿瘤时发现的，正常时，巨噬细胞对肿瘤细胞无杀伤作用，但该因子能使之获得特异性杀伤肿瘤的作用。 B、作用于白细胞的因子1979年，在瑞士举行的第二界国际淋巴因子专题讨论会上，将作用于白细胞的因子统称为白细胞介素（interleukin,IL）。a、IL-1：IL-1为一种蛋白质，由一条多肽链组成，分子量12000~18000，可由细菌脂多糖、抗原抗体复合物和某些细菌激活单核巨噬细胞和树突状细胞产生，其作用是作为Tc激活的第二信号，通过激活Th细胞，以促进Bc产生抗体，并诱导Th细胞产生IL-2。 b、IL-2IL-2为一种糖蛋白，是IL-1诱导Th产生的，其作用有：ⅰ诱导产生Tk细胞，并使致敏的Tk活性大大加强，并维持其持续增长和在体外长期生长。ⅱ促进Th增殖，并维持其在体外长期生长。ⅲ增强干扰素的生成。ⅳ增强NKc的功能，为肿瘤治疗提供手段。由于IL-2在生产中应用很广，现已利用细胞杂交技术获得了产生IL-2的杂交细胞株,但IL-2对休止期淋巴细胞无作用。 c、IL-3是新近发现的一类作用于淋巴细胞的因子，是IL-1激活Th后产生的，其促进多种淋巴细胞分化、增殖方面与IL-2相同，但IL-3主要作用于未成熟的淋巴细胞，使之分化，并对嗜碱性粒细胞和肥大细胞的生长有调节作用。 C、作用于淋巴细胞的淋巴因子a、促分裂因子（MF）：促进淋巴细胞合成DNA，使正常Tc转化为淋巴母细胞，激活的淋巴母细胞又能合成、释放非特异性淋巴因子以扩大效应。b、转移因子（TF）：使正常Tc转化为致敏淋巴细胞，从而增强细胞免疫反应。转移因子易提纯，不具抗原性，不引起免疫反应，人医上用于传染病的辅助治疗。 D、作用于靶细胞的淋巴因子a、淋巴毒素（LT）：又称细胞毒淋巴因子，对靶细胞进行胞外杀伤，还能通过靶细胞膜进入胞内，抑制靶细胞分解。b、干扰素：Tc受抗原刺激后能分泌一种干扰素，称为Ⅱ型干扰素，区别于其它细胞受病毒作用产生的干扰素（称Ⅰ型干扰素），Ⅱ型干扰素常分泌到体液中，作为有机体的正常抗微生物物质，也可进入细胞内，干扰病毒繁殖。 E、作用于血管的淋巴因子使血管通透性增强，血液中吞噬细胞和正常抗微生物物质易进入组织间隙，在组织间隙发挥作用。 （三）细胞免疫的主要作用1、细胞性抗感染免疫：（1）对胞内菌的抗感染免疫：如结核、布氏、李氏、马鼻疽。（2）对病毒的抗感染免疫。2、免疫监视和肿瘤免疫：Tk细胞杀伤肿瘤细胞的作用。3、引起Ⅳ型变态反应。4、同种移植免疫：致敏Tc对移植组织的主要组织相容性抗原进行识别，产生各种淋巴因子，配合Tk细胞的细胞毒作用，引起移植组织细胞伤害，从而排除移植组织。 细胞免疫应答图示 二、体液免疫应答（一）概念：Bc接受抗原刺激后引起的免疫反应。（二）体液免疫过程1、感应阶段2、反应阶段3、效应阶段 B细胞的表面标志SmIg：B细胞表面的抗原受体是细胞表面的免疫球蛋白。 （二）体液免疫过程1、感应阶段（1）抗原的加工与传递：a、非Tc依赖性抗原（如肺炎双球菌荚膜抗原，大肠杆菌脂多糖抗原），直接活化Bc，原因在这类抗原的抗原性强，表面有多个相同的、重复排列的抗原决定簇，能与Bc表面的特异性抗原受体牢固结合，使Bc表面受体位移，交联，并引起Bc活化，但这类抗原较少。b、Tc依赖性抗原：抗原进入机体后，首先为吞噬细胞吞噬，大部分被消化降解，失去抗原性，少部分形成抗原决定簇-MHC复合物（超抗原），传给Th，再传给Bc。此类抗原较多。c、巨噬细胞依赖性抗原：Ag→巨噬细胞→Th→巨噬细胞→Bc，是b的特殊形式。 （2）细胞的活化除非Tc依赖性抗原外，BC活化，需双信号系统的刺激，第一信号来自超抗原的抗原决定簇特异性刺激，第二信号来自：（1）非T细胞依赖抗原：无，但多个相同的抗原决定簇构成链状抗原分子，与B细胞表面抗原受体发生交叉联结，引起抗原受体移动，最后形成帽状结构，激发Bc活化，相当于第二信号。（2）Tc依赖抗原和巨噬细胞依赖抗原：巨噬细胞产生的淋巴细胞激活因子（LAF），TH产生的BC活化因子，激活的补体细胞。 2、反应阶段无活性的Bc在双信号刺激下活化，增殖分化为浆母细胞，多数再分化成浆细胞，少数分化成记忆Bc细胞，前者产生抗体，后者保持记忆，但不同的抗原刺激产生抗体的规律不一样：（1）非Tc依赖性抗原：主要产生IgM，IgG很少，但缺乏免疫记忆，即不分化出记忆Bc。（2）Tc依赖性抗原：产生抗体有一定规律，先IgM，后IgG。受抗原刺激的某一个Bc增殖的后代，称为单克隆无性细胞系，其产生的抗体具相同的特异性，即都特异地针对该抗原，但这种单克隆细胞产生抗体的类型可发生改变，或IgM，或IgG、D、E、A， 3、效应阶段指浆细胞产生抗体进入血循环或粘膜表面，发挥作用的阶段。抗体发挥作用有以下几个特性：（1）高度特异性：只作用于相应的抗原，甚至抗原决定簇。（2）几种抗体分工合作：IgM：产生早，作用强，只存在于血液，能结合补体，但含量低，半衰期短，主要对细菌、螺旋体等细胞性抗原起作用。IgG：产生晚，但含量多，半衰期长，血液、组织中均存在，能结合补体，主要对抗细菌，中和病毒和毒素。IgA：主要在粘膜表面及分泌液中发挥抗感染作用。IgE：主要抗寄生虫感染。 （3）作用方式的多样性A、中和作用：指抗毒素或病毒中和抗体与外毒素或病毒结合成抗原抗体复合物，使之失去致病性的作用。但这种复合物只能限制毒素或病毒的迅速扩散，不能彻底消灭，必须依靠非特异性免疫系统，如补体、吞噬细胞的作用，其中和机理是：外毒素：外毒素引起致病是由毒性基团引起的。产生抗毒素是由抗原决定簇决定的，抗原抗体复合物的形成，使外毒素失去毒性，并非直接作用于毒性基团，而是掩盖邻近的毒性基团，或使毒素发生分子构型的改变而失去毒性。病毒：病毒必须进入机体细胞大量繁殖，才能发挥致病作用，抗原抗体复合物的形成，使病毒失去活性和致病力。 （3）作用方式的多样性B、凝集作用：抗体与细菌抗原在体内凝集形成团块，限制细菌的活性，在补体和吞噬细胞协助下消灭。C、ADCC效应：指IgG与细胞性抗原结合后，暴露IgG的Fc段，易与Kc的Fc段受体结合，通过KC进行胞外杀伤的作用。D、调理作用：指IgG与抗原性异物结合后，暴露Fc段，易与吞噬细胞的Fc段受体结合，从而促进吞噬功能的作用。E、免疫粘联作用：指抗原抗体复合物易激活补体，形成抗原抗体补体复合物，再与有补体受体的红、白细胞、血小板结合成大的复合物，从而彻底消灭抗原的作用。F、溶解作用：指抗体与细胞性抗原结合后，活化补体，使细胞溶解的作用。 （4）抗体作用的不彻底性：（5）作用的双重性：一方面消灭抗原性异物，对机体有利，另一方面，引起炎症，组织坏死，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型变态反应，对机体不利。 体液免疫过程 三、免疫反应的相互关系（一）非特异性免疫与特异性免疫的关系：1、非特异性免疫是特异性免疫的前导：即特异性免疫是在非特异性免疫基础上建立起来的，如Tc、Bc的活花都需要巨噬细胞的作用。2、二者互为补充：非特异性免疫发挥作用快、范围广，但作用弱，遇强敌入侵，必须调动特异性免疫。特异性免疫的发挥反过来又加强非特异性免疫。 （二）细胞免疫与体液免疫的关系1.协同作用：一种病原体常有多种抗原决定簇，能同时激发集体的细胞免疫和体液免疫，二者协同作用，最终达到彻底消灭病原的同一目的，但不同的病原，常以某种免疫为主，或同时存在。（1）细菌：胞外寄生菌：如巴氏杆菌，以体液免　　　　　　　　　　　疫为主。胞内寄生菌，如结核分支杆菌，以细　　　　　　　　　　　胞免疫为主。（2）外毒素：体液免疫为主。（3）病毒：体液免疫和细胞免疫同样重要，前者对进入细胞前和从细胞内释放的病毒起中和作用，后者通过干扰素对胞内病毒起作用，以及淋巴因子促进巨噬细胞吞噬消灭的作用。 2、拮抗作用是对机体不利的，如机体正常细胞变异为肿瘤细胞后，作为一种新的抗原，刺激机体体液免疫产生抗体，但抗体与肿瘤细胞结合不能杀伤肿瘤细胞，且不断生长。肿瘤细胞与抗体结合后，一方面，其表面抗原被占据，Tk细胞受体难于与之结合，另一方面，表面抗原从肿瘤细胞上脱落，与Tk细胞受体结合，减少了能杀伤肿瘤细胞的Tk细胞数量，从而抑制了细胞免疫。 第五节　抗体（Antibody:Ab）一、抗体的概念二、有机体产生抗体的一般规律三、抗体产生的理论四、抗体的基本结构和功能五、抗体的种类六、各种抗体的特性七、抗体的抗原性八、抗体的生物学活性九、单克隆抗体（Monoclonalantibody） 一、抗体的概念抗体是有机体在抗原刺激下产生的，并能与抗原发生特异性结合的一类球蛋白的总称。抗体存在于血清、淋巴液、粘膜分泌物和组织中，但以血清中含量最高，制备抗体也常从血清中获得，所以抗体又常称为抗血清。因抗体活性部位位于球蛋白的γ区，所以抗体又称为γ-球蛋白或丙种球蛋白。1964年，将具抗体活性以及与抗体有关的球蛋白统称免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）,Ig对酸、碱、热、光都较敏感，易为之破坏。 二、有机体产生抗体的一般规律（一）初次反应：某种抗原首次进入机体所产生的免疫。1、有一定潜伏期：潜伏期指抗原进入机体到血清中出现抗体所持续的时间，一般病毒的潜伏期2天，细菌3-5天，类病素2-3周，而且死菌潜伏期比活菌更长。2、产生的抗体量不高，只能达到最大量的20-30%。3、先产生IgM，当其将消失时，IgG达最大量，再过2周才出现IgA。 （二）再次反应某种抗原进入机体后的一定时期，相同抗原第二次再次进入时所发生的免疫反应，称为再次反应。再次反应的特点有：1、无潜伏期，抗体量先急剧下降，是由于第二次进入的抗原与机体中抗体发生了抗原抗体结合，约2-3天后，又急剧上升。2、抗体量可达初次反应的10-50倍，是由于第一次的记忆细胞被激活，发挥作用。3、抗体高峰期维持时间长，下降缓慢。4、主要是IgG。第三次注入相同抗原时所发生的反应与再次反应一样，依此类推。但不能无限地注射抗原，否则发生免疫耐受，一般最多5次，不超过6次，高免血清就是依此原理制成的。 （三）回忆反应第一次注射抗原后，产生的抗体即将消失或已经消失时，再注射同种抗原所发生的反应称为回忆反应。回忆反应的特点与再次反应基本相同。血清中抗体量急剧上升，且量很大，也是记忆细胞的作用。高峰期维持时间长，下降缓慢，主要是IgG。但有较短的潜伏期，一般2-3天。 抗体产生规律图示 三、抗体产生的理论（一）侧链学说：最先于1900年由Erlich提出，认为产生抗体的细胞表面有特异性受体，抗原与受体特异性结合,以后脱落,脱落的受体就是抗体。（二）模板学说（Templatetheory）：1、直接模板学说：最初于1930年Celexunder提出，认为机体免疫细胞以抗原为模板，合成在空间结构上与抗原分子互补的抗体，所以二者能特异性结合。2、间接模板学说：于1940年Bernet提出，认为抗原作用于抗体形成细胞，使之产生适应酶或mRNA，再由酶催化或以mRNA为模板形成与抗原分子能特异结合的抗体。 （三）克隆选择学说（Cloneselectiontheory）最先于1955年用Jerne提出，自然选择学说（Naturalselectiontheory），后于1957年由Bernet对之修订，提出克隆选择学说，是目前认为比较合理，为大家所公认的学说。该学说既解释了机体为什么能识别多种多样的抗原，产生相应抗体，又解释了对自身抗原的不攻击，以及自身免疫病的发生。 （三）克隆选择学说1、对多种多样抗原的识别：认为动物体内存在着大量（约107）的淋巴细胞克隆，每一克隆表面都带有特异的Sig，进入体内的外来抗原或内源性抗原能选择性激活带相应受体的淋巴细胞克隆，使之分化增殖，产生相应抗体。 克隆选择学说 （三）克隆选择学说2、识别自身和非自身：认为胚胎期的淋巴细胞有与抗原结合的能力，但不具备产生抗体的潜能，在此期接触相应抗原，则该克隆反而损伤而被消除，所以，胚胎期出现的自身抗原使相应的淋巴细胞损伤，从而消除对自身抗原起反应的细胞，只留下针对非自身抗原起反应的细胞，称为天然免疫耐受。同样道理，如在胚胎期人工给予非自身抗原，也可使其丧失对该抗原相应的细胞，称人工免疫耐受。 （三）克隆选择学说3、自身免疫病：即对自身抗原起反应而引起的病理变化，认为是由于胚胎期自身抗原对相应淋巴细胞反应，本应被消除，但由于这种淋巴细胞在机体清除功能下降的情况下，大量增殖，而残留下来，出生后对自身抗原识别，产生抗体，引起自身免疫病。 四、抗体的基本结构和功能（一）抗体分子的基本结构每个抗体分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，重链之间，轻重链之间，链内均由二硫键联结。 （四）抗体的抗原结合部位抗体的抗原结合是由重链可变区和轻链可变区构成与抗原决定簇表面互补的分子构型而与抗原结合的，一个抗体分子单体有两个抗原结合位点。 （五）抗体分子的酶解片段（1）木瓜蛋白酶酶解：用木瓜蛋白酶酶解IgG，可获得3个片段，两个单体的Fab段，能结合抗原；一个包含CH1、CH2的可结晶片段，称Fc段。（2）胃蛋白酶酶解：用胃蛋白酶酶解IgG，获得一个双价的能结合抗原的片段，称F(ab‘)2片段和数段小分子多肽。 五、抗体的种类（一）根据抗体与抗原结合后，是否出现可见反应分类：1、完全抗体：又称二价或多价抗体，因完全抗体的单体都具有两个或两个以上的抗原结合位点，而且与抗原结合后，能出现可见反应，如凝集反应、沉淀反应。属IgM或IgG，一般所称的抗体都是完全抗体。2、不完全抗体（Imcomplateantibody）：又称单价抗体或封闭抗体，因IgG的两个抗原结合位点之一不活动而失去功能，只一个位点能与抗原结合，故不能形成大的抗原抗体复合物，故不出现可见反应。但不完全抗体能封闭抗原的抗原决定簇，阻止抗原与完全抗体结合，而不出现可见反应。 （二）根据抗原抗体反应类型分类1、沉淀素（precipitin）：即能与可溶性抗原发生沉淀反应的抗体。2、凝集素（agglutinim）：指与颗粒性抗原发生凝集反应的抗体。3、补体结合抗体（complementlikingantibody）：指与抗原结合后能吸引补体，引起补体结合反应的抗体。4、中和抗体（neutralizingantibody）：指能与病毒结合，并使病毒丧失对易感细胞感染力的抗体。5、溶解素（lysin）：指与细胞膜上抗原结合，在补体作用下使细胞裂解的抗体。 （三）根据抗体来源不同分类1、免疫抗体：指机体在后天生活过程中，受抗原刺激而产生的抗体。2、天然抗体：指先天获得的，不须后天抗原刺激即具有的抗体。 （四）根据抗体组成结构不同分类1、类：根据抗体重链稳定区的氨基酸组成不同分为亚类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。2、亚类(subclass)：根据抗体重链稳定区结构上较微细的差异分为亚类：IgG：分成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4IgA：分成IgA1、IgA2IgM：分成IgM1、IgM2IgD和IgE还未发现亚类。 3、型(type)：根据Ig轻链稳定区结构不同，将Ig分为两个型，即K型和λ型。一个Ig分子的两条轻链同为K型或λ型。4、亚型(subtype)：在Ig的λ型中，根据轻链稳定区氨基酸微细差异分为亚型。OZ(+)亚型：190位氨基酸为亮氨酸OZ(-)亚型：190位氨基酸为精氨酸Kern(+)亚型：154位氨基酸为甘氨酸Kern(-)亚型：154位氨基酸为丝氨酸5、亚群(subgroup)：根据Ig重链和轻链可变区结构特点，分为数组不同亚群。 六、各种抗体的特性（一）IgG：由一个抗体分子构成。是抗体的主要抗感染抗体，能对细菌、病毒、毒素发挥免疫功能，占血清Ig总量的75-80%作用，特点是半衰期长，约25天，人的IgG能通过胎盘传给胎儿，但家畜不能，但人畜的初乳中IgG含量均较高，所以家畜主要从初乳中获得母源IgG，对新生胎儿抗感染起重要作用，分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚类。 （二）IgA1、血清型IgA：在血清中含量仅次于IgG，约占5-25%。主要由一个抗体分子构成。主要来自肠系膜淋巴组织的浆细胞，主要为IgA1（占血清IgA总量的约80%）。2、分泌型IgA：存在于唾液、泪液、初乳、呼吸道、胃肠道、胃液等分泌液中，是机体粘膜局部抗感染的重要因素，故又称局部抗体，其含量比血清型IgA高6-8倍，主要为IgA2，由两个抗体分子和一个分泌片，一个J链组成，抗感染作用比血清型IgA强。 （三）IgM主要存在于血清，是分子量最大的Ig，故又称巨球蛋白，以五聚体通过J链联结形成，常表现五个抗原结合价，所以在凝结作用，活化补体，溶菌作用等方面比IgG大250倍，特别在感染初期，控制菌血症，败血症上起重要作用。 （四）IgD只在人、小白鼠中发现少量的游离IgD，其它动物未发现，量少，半衰期短，仅3天，因此研究困难，目前未发现具免疫活性。发生过敏反应，自身免疫疾病的个体，IgD增加，但作用仍不清。 （五）IgE为单体，正常人畜IgE含量很低，只是在引起I型变态反应时其量才显著升高，因IgE对肥大细胞、嗜碱性粒细胞、血管内皮细胞具亲嗜性，易与之结合，当同种抗原再次进入时，能与结合在肥大细胞上的IgE结合成复合物，使肥大细胞脱颗粒，释放组织胺等活性物质，引起I型变态反应。IgE主要由鼻咽部、扁桃体、气管、支气管、胃肠道等粘膜固有层的浆细胞产生，血清中半衰期仅2-3天。 七、抗体的抗原性（一）概念：抗体的抗原性指抗体进入机体后，可作为抗原刺激机体产生抗体，称为抗抗体，这种抗抗体且能与相应的抗体发生结合产生特异性免疫反应。一种抗体常由于结构不同而具有几种抗原型。 七、抗体的抗原性（二）抗原型分类1、同种型：指同种动物的不同个体Ig之间具有的共同抗原。前面提到的Ig的类、亚类、型、亚型、亚群所涉及的抗原，都属同种型抗原，这种抗原对同种个体不具抗原性，对异种动物具抗原性，可用之生产抗抗体。2.、同种异型：指同种动物的不同个体之间，由于Ig重链和轻链稳定区上1-2个氨基酸的不同而表现的不同抗原性，如IgG的CH上发现有1-25个同种异型抗原，分别为Gm1~Gm25。3、个体型：指同一个体产生的特异性不同的Ig分子，其可变区氨基酸组成不同，构成了种类繁多的不同专一特异性的抗原。 八、抗体的生物学活性（一）与特异性抗原结合：抗体的抗原结合部位与抗原决定簇的结构是互补的，决定了其结合的特异性，这种互补结构是由遗传决定的，一个抗原分子能与多个抗体结合，相互联结起来，呈现可见的免疫反应，如沉淀反应、凝集反应等。 八、抗体的生物学活性（二）激活补体：IgG（IgG4除外）和IgM能激活补体经典途径，是由于抗体与抗原结合成复合物后，原来呈“T”状态，转变成“Y”状态，使原来被掩盖的Fc段补体结合位点暴露，从而与C1q结合引起的。IgG4、IgA、IgE、IgD能以Fab段激活补体替代途径。 八、抗体的生物学活性（三）细胞结合：1、IgG结合Kc：ADCC2、IgE能同组织中肥大细胞、嗜碱性粒细胞等结合，引起I型变态反应。3、结合吞噬细胞：调理作用，指增强吞噬细胞吞噬作用称调理作用，具调理作用的物质称调理素，机体中抗体和补体是主要的调理素，其调理机制有两个方面：①抗体与颗粒性抗原结合成复合物后，能改变抗原的表面电荷，使之静电排斥力减弱，有利于吞噬细胞靠近抗原，发挥更大的吞噬作用。②抗体与抗原结合后，Fc段暴露，与吞噬细胞的Fc受体结合，抗原与吞噬细胞间距离缩短。 单抗的制备过程动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化 第三章免疫学防治（Immunologicprophylaxisandtherapy）一、概述二、天然自动免疫三、人工自动免疫四、天然被动免疫五、人工被动免疫 一、概述免疫学防治就是应用免疫学知识对疾病进行预防和治疗。传统免疫学时期，只限于防治传染病，60年代后，发展到了防治非传染病，如变态反应性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病、肿瘤等， 二、天然自动免疫动物隐性传染或传染病康复而自动获得的免疫力，称为天然自动免疫。不同病原微生物使动物获利的天然自动免疫力和免疫期不同，有的免疫力低、免疫期短，有的免疫力坚强、免疫期长。 三、人工自动免疫（一）概念（二）人工自动免疫生物制品的种类　　　及特点（三）疫苗生产及质量监测（四）免疫方法（五）免疫程序（六）影响人工自动免疫的因素 （一）概念将疫苗、类毒素等生物制品接种于动物，使其产生针对相应抗原的免疫力，以达到预防传染病的目的，称人工自动免疫。如猪瘟兔化弱毒接种猪预防猪瘟等。 （二）人工自动免疫生物制品的种类及特点兽医学上常用的人工自动免疫生物制品有菌苗、疫苗、类毒素。菌苗由细菌制成，疫苗由病毒、立克次氏体、螺旋体等制成，类毒素由细菌外毒素制成。但习惯上将菌苗和疫苗统称疫苗。 1、死疫苗用物理的或化学的方法，将病原微生物杀灭，使之失去致病性，但仍保持完整的抗原性，进入机体能刺激机体产生特异性免疫反应的疫苗统称为死疫苗。如猪丹毒氢氧化铝甲醛苗。优点：（1）易保存，有效期长，15℃保存即　　　　　　　可。缺点：（1）注射剂量大，需多次注射。（2）潜伏期长，免疫期短，一般几个　　　　　　　月，最多不超过1年。（3）注射局部和全身反应明显。 2、活疫苗用某种方法使病原微生物减毒或用无毒病原体制成的疫苗，称活疫苗。由于毒性减弱或无毒，故不致病，且抗原性保存，能刺激机体产生免疫反应，如猪瘟兔化弱毒疫苗。(1)优点：a、免疫原性好，一般注射一次即　　　　　　　能达到免疫效果。b、免疫期长。c、用量小(2)缺点：a、不易保存，须4℃以下保存。b、有效期短，特别是湿苗。现在　　　　　　　制成冻干苗有效期稍长。 3、类毒素细菌外毒素经处理后，对机体毒力减弱，不再引起发病，仍保持抗原性，能刺激机体产生免疫反应的一类生物制品，如破伤风类毒素。特点：体内吸收缓慢，能较长时间刺激机体产生足量的抗毒素，故免疫效果较好。 4、多联苗将用于同一动物的几种疫苗用适当的方法混在一起制成的生物制品。起到一次注射，防治多种传染病，节省人力、物力的目的。如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗；兔瘟、兔巴氏二联苗；羊猝疫、羊快疫、羊肠毒血症三联苗等。 5、亚单位疫苗用适当方法提取病原微生物具免疫活性的结构单位，去掉具毒性的结构单位，经浓缩而配制成的疫苗。如禽巴氏荚膜亚单位疫苗、大肠杆菌K88疫苗等。优点：(1)病原体被破坏，不完整，故失　　　　　去致病性，安全性好。(2)免疫原性好，因具免疫原性的　　　　　结构单位被提取，浓缩。缺点：制造困难，造价高。 6、基因工程疫苗将病原微生物具免疫原性的有用基因用酶切的方法切下，抽提出来，重组到质粒载体上，再导入非致病微生物，培养非致病微生物而制成的疫苗，被称为第二代疫苗。优点：①安全性好，因只取免疫基因，去掉　　　　　毒性基因。②易于大量生产。③可将几种免疫基因（同一微生物的，　　或几种微生物的）同时重组到一个质粒　　　　载体上，扩大免疫预防范围。如大肠杆菌K88疫苗+K99+9879基因工程疫苗。 7、合成肽疫苗在研究清楚病原微生物保护性抗原氨基酸组成的基础上，用人工的方法合成这种多肽链而制成的疫苗。被称为第三代疫苗。如口蹄疫合成肽疫苗。此种疫苗前景可观，但在目前科学发展水平上，造价昂贵。 8、抗独特性抗体疫苗9、基因疫苗 （二）兽医学上常用的人工被动免疫生物制品1、抗菌血清：将病原菌多次免疫动物获得的含较高特异性抗体的高免血清，如抗炭疽血清，现用得较少，为抗菌素所替代。2、抗病毒血清：用弱毒或强毒多次免疫动物获得，如抗猪瘟高免血清。3、抗毒素：用类毒素多次免疫动物获得，如破伤风类毒素。4、其它：如禽的卵黄制品，兽医上较常用，因经济实惠，如用雏鸭肝炎病毒免疫产蛋母鸭，其蛋中含有较高特异性抗体，用来紧急治疗雏鸭病毒性肝炎。 （三）人工被动免疫生物制品的使用原则及注意事项1、把握好时期：一般在潜伏初期使用，越早越好。由此才能将刚进入体内的少量病原微生物彻底消灭。如已经大量繁殖，或进入细胞内，则作用减弱，或不起作用。2、剂量和次数：一般剂量较大，才能彻底消灭。紧急预防，一般注射一次，治疗则需间隔一定时间多次使用。3、注意防止过敏反应的发生。 第四章免疫学诊断（Immunologicdiagnosis）第一节血清学反应概述第二节凝集实验第三节沉淀反应第四节补体结合实验第五节荧光抗体技术第六节酶标抗体技术 第一节血清学反应概述一、血清学反应的一般特点二、血清学试验的应用三、血清学试验的发展趋向 一、血清学反应的一般特点（一）特异性和交叉性：一种微生物抗原只与其相应的抗体发生结合，称为血清学反应的特异性。但有些微生物抗原之间含有部分相同的抗原，或部分相同的抗原决定簇，或抗原决定簇间有相同或相似的构型。则发生血清学的交叉反应。亲缘关系越近，交叉反应程度越高。免疫学诊断应尽量选择无交叉反应的抗原。交叉反应一般是双向的，但也有单向的。 （二）结合力和离解力1、结合力：抗原抗体的结合力决定于抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间所形成非共价键的数量，性质和距离。非共价键数量多，高能结合键（氢键、离子键）比例高，分子间距离近，则结合力强，不易离解，称高亲和力。反之，为低亲和力。介于二者之间为中亲和力。2、离解力：抗原抗体这种表面结合，最适于0~40℃，pH4~9范围内进行，温度高于60℃，或pH＜3，则发生离解。根据这一特性，用免疫吸附层析提取免疫纯的抗原或抗体。 （三）抗原抗体结合的最适比和带现象抗原抗体须在适当比例下才出现可见反应，比例越合适，反应越明显，这个比例称为抗原抗体反应最适比。在最适比时，抗原抗体才能形成大的复合物。如果抗原过多或抗体过多，则抗原抗体不能形成大的复合物而不呈现可见反应，称为带现象。如果抗体过剩，一个抗体分子只能结合一个抗原，形成可溶性小分子复合物，称为前带。如果抗原过剩，两个抗原分子只能与一个抗体结合，仍为小分子复合物，称后带。在凝集反应中，常抗体过剩而出现前带，一般固定抗原浓度，抗体第近稀释。沉淀反应中，常抗原过多而出现后带，一般固定抗体浓度，抗原递近稀释。或二者同时第近稀释，用方阵测定最适比。 最适比和带现象图示 （四）反应的二阶段性：抗体反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异结合，但无可见反应，第二阶段为抗原抗体的可见阶段，表现为凝集，沉淀，补体结合等反应。前者快，几秒至几分钟，后者慢，几分钟，几十分钟或更久。（五）反应的敏感性：具极高的敏感性，不仅可定性，还可检测极微量的抗原或抗体。 （六）影响抗原抗体反应的因素1、电解质：沉淀反应、凝集反应时，一般用0.15M的NaCl，但禽类血清须8-10%NaCl，主要是降低抗原抗体结合物表面负电荷，促进沉淀、凝集。补反或溶血反应时，稀释液加少量Ca+、Mg+，以增强补体活性。2、PH值：最适pH6-8，如pH5-5.5时，蛋白质发生等电点沉淀，＜2.5时离解。3、温度：常用37℃或低温，56℃离解。4、机械振荡：增加分子间碰撞，但强烈振荡时离解。5、杂质：引起非特异性反应。 二、血清学试验的应用1、抗原抗体的快速检测。2、生物活性物质的超微定量：如测定激素、药物等。3、抗原或抗体在细胞和亚细胞水平的定位。4、抗原组成成分分析。5、微生物鉴定和抗原分型。6、血型鉴定。 三、血清学试验的发展趋向1、质量上：向高度特异性、敏感性、精密分辨能力，高水平定位和简易快速方面发展。2、实验方法上：向微量法方面发展，以微量滴定板代替试管。3、检测仪器上：从手工操作向自动血清学反应设备发展，如自动化血清学反应仪可进行多种血清学实验，只须提供样品和试验材料即可自动进行。反应结果用电子仪器自动记录，分析。4、方法的标准化和试剂的商品化，如标准的商品试剂盒。 第二节凝集实验（一）凝集实验概念（二）直接凝集试验：（Directagglutinationtest）（三）间接凝集实验 （一）凝集实验概念细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在下，抗原颗粒相互凝集成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。参加反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。 （二）直接凝集试验1、玻片凝集实验2、试管凝集实验3、生长凝集实验 1、玻片凝集实验用已知的抗原（抗体）与待检的血清（或菌液）各一滴在玻片上混合，数分钟后，出现颗粒性或絮状凝集，即为阳性反应。如血型鉴定，沙门氏菌分型，布氏杆菌、鸡白痢检疫等，此法简便快速，但只能定性。 玻片凝集实验图示 2、试管凝集实验（1）用于抗体的定性和定量：检测待检血清中是否存在相应抗体和测定抗体的效价。将待检血清用生理盐水作倍比稀释，加入等量抗原，370C水浴数小时，视不同凝集程度记录为++++（100%）、+++（75%）、++（50%）、+（25%）、－（不凝集）。发生50%凝集的血清最大稀释度称为该血清凝集价（或称滴度）。由于某些细菌常发生自身凝集，或酸凝集，故实验时必须设阳性抗原、阴性抗原、生理盐水对照。反应中最初几管常由于抗体过剩而不凝集，为前带现象。有些细菌与其它菌含共同抗原，发生交叉凝集，出现假阳性反应，应注意区别。但交叉凝集的凝集价一般比特异性凝集价低。 试管凝集实验图示 2、试管凝集实验（2）用于单因子血清制备：利用交叉　　凝集的特性。A菌：AC抗原ac抗体+B菌a抗体+（B菌-；A菌+）B菌：BC抗原bc抗体+A菌c抗体+（A菌-；B菌+） 3、生长凝集实验抗体与活的细菌（或霉形体）结合，在没有补体存在时，不能杀死和抑制细菌生长，但能使细菌呈凝集生长，借显微镜观察培养物是否凝集成团，以检测加入培养基中的血清是否含相应抗体。 （三）间接凝集实验将可溶性抗原（抗体）吸附于与免疫无关的小颗粒载体表面，此吸附抗原（抗体）的载体颗粒与相应的抗体（抗原）结合，在电解质存在的适宜条件下发生的凝集反应，称间接凝集反应，又称被动凝集反应。吸附抗原的常用载体有动物红细胞，聚苯乙烯乳胶，活性炭等。吸附抗原后的颗粒称致敏颗粒。 （三）间接凝集实验1、乳胶凝集试验：利用聚苯乙烯乳胶微球，吸附某些抗原（抗体），用以检测相应的抗体（抗原）。常用玻片法，也可用试管法。2、炭素凝集实验：利用活性炭颗粒表面有许多蜂窝状结构，能吸附抗原或抗体，制成致敏炭素，用以检测相应的抗体或抗原。如腺病毒抗体检测。 3、间接血凝实验（1）正向间接血凝：用红细胞（如绵羊、兔、鸡、O型人血液）吸附抗原，检测相应抗体的方法。吸附抗原的红细胞称致敏血球。多糖，类脂等半抗原可直接吸附于红细胞上，蛋白质抗原须用鞣酸处理使其表面活化，或用偶氮联苯胺等联结剂，才能吸附于红细胞表面。红细胞常用甲醛、或戊二醛、丙酮等固定，使之易较长时间保存。试验常在微孔型塑料板上进行，结果判定用试管凝集反应的方法。 3、间接血凝实验（4）固相间接血凝：利用聚苯乙烯塑料板做固相载体，吸附抗原或抗体，在吸附板上进行的血凝试验，称固相间接血凝，常用抗抗体或SPA致敏红细胞，使一种致敏红细胞能用于多种抗体系统的检测，使检测试剂商品化，通用化，同时既有间接血凝简易快速，又有ELISA高度敏感性和特异性的优点。A、夹层法：抗体（IgG）包板+封闭液+待检抗原+抗体致敏红细胞B、双抗体法：抗原包板+待检血清+抗抗体致敏红细胞 4、协同凝集实验大多数金黄色葡萄球菌具有蛋白A（SPA），利用SPA能与IgGFc段结合而制成致敏SPA菌悬液，与待检抗原在平板上混合，互相联结，凝集作用增强，称协同凝集实验。广泛用于细菌性疾病的快速诊断。 第三节沉淀反应一、概念二、环状沉淀实验三、絮状沉淀实验四、琼脂扩散沉淀实验五、对流免疫电泳（CIEP：counter-immuno-electro-phoresis）六、火箭免疫电泳 一、概念可溶性抗原（细菌外毒素、菌体悬浮液、病毒、血清、组织液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称沉淀实验。所用抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。沉淀反应常抗原过剩，形成后带现象，故通常稀释抗原，并以抗原稀释度为沉淀实验效价。 二、环状沉淀实验在小口径试管内加入已知抗血清，然后小心加入待检抗原于血清表面，使之成为分界明显的两层，数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。主要用于抗原定性，如炭疽Ascoli氏反应，也可用于沉淀素效价滴定，出现白色沉淀带的最高抗原稀释倍数，即为血清的沉淀价。 环状沉淀实验图示 三、絮状沉淀实验抗原、抗体在试管内混合，有电解质存在时，抗原抗体复合物可形成浑浊沉淀或絮状沉淀物，抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，浑浊度最大，抗原过剩或抗体过剩，则反应出现时间延迟，沉淀减少，甚至不出现，形成前带或后带现象，故将抗原抗体同时稀释，用以测定抗原、抗体反应最适比例。 四、琼脂扩散沉淀实验（一）原理：即双向双扩散，为当今常用。用生理盐水制成1%琼脂液，倒于平板内制成凝胶，该凝胶孔径约85nm，能允许抗原抗体在其中自由扩散，并由近及远形成浓度梯度，当二者在比例适当处相遇，发生沉淀反应，形成的沉淀颗粒较大，在凝胶中不再扩散，而形成白色沉淀带，沉淀带一经形成，就象特异性屏障，继续扩散来的相同抗原、抗体，只能使沉淀带加浓加厚，而不再向外扩散，但对其它抗原抗体系统无屏障作用。一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带，多种抗原抗体系统则形成多条沉淀带。 四、琼脂扩散沉淀实验2、操作：制成琼脂板后，一般打成梅花形孔，直径约5㎜，孔距4㎜，中间孔加标准抗原（抗体），周围孔加待检抗体（抗原），置于湿盒，24-48小时观察结果。3、应用及结果观察：（1）抗原定性检测：传染病诊断，结果观察时，注意沉淀线形态，确定是否有交叉。（2）抗体定性检测：用于传染病诊断及检疫，注意沉淀线形状，反应血清强弱。（3）用于抗原或抗体纯度检测：如果抗原不纯，与制备的抗血清之间出现两条或以上的沉淀线。（4）抗体效价测定。 四、琼脂扩散沉淀实验4、沉淀线形状与抗原抗体浓度及扩散速度的关系：（1）抗原、抗体浓度及扩散速度相似时，沉淀线呈直线，位于两孔正中。（2）如抗原抗体浓度不平衡，必定是浓度高的一侧反应物过剩，使局部沉淀线或全部溶解，随着沉淀物的溶解，扩散的继续，新的沉淀物重新形成，沉淀线向浓度低的一侧移动。所以，如果沉淀线偏向孔间的一侧，必定是该侧反应物浓度低于对侧。如果沉淀线是全部溶解，向前推进又重新形成，沉淀线常出现前缘呈刀刃状和较分散的尾巴。如果沉淀线部分溶解，则形成较宽的沉淀线。（3）如抗原抗体扩散速度不同，沉淀线则弯向扩散速度慢的一侧。 琼脂扩散沉淀实验图示 1.双扩散用于疾病诊断：以IBD诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原1.2.3.4。2.双扩散用于抗体检测：以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清.、IBD阴性血清、待检血清1.2.3.4。 五、对流免疫电泳1、原理：是用电泳来加速抗原抗体定向扩散的双向免疫电泳扩散技术。在pH8.6的琼脂电泳中，琼脂中含琼脂果胶，有一种从阳极向阴极的电渗作用力，大部分抗原带较强的负电，克服电渗作用力，向阳极泳动。而血清中蛋白质也向阳极移动，大多数IgG带微弱负电向阳极泳动的速度很慢，在电渗力作用下，反向阴极倒退，故将抗原加在阴极，抗体加在阳极。二者相遇形成沉淀线。由于电泳使抗原抗体定向移动，使反应敏感性增加，特异性好，结果迅速，方法简便。 五、对流免疫电泳2、操作（1）缓冲液配制：电泳槽缓冲液：常用pH8.6,0.05M巴比妥缓冲液：巴比妥：1.81g巴比妥钠10.3g蒸馏水1000ml琼脂板缓冲液：常用pH8.6，0.025M巴比妥缓冲液，上述缓冲液对倍稀释即可。（2）琼脂板制备：用琼脂板缓冲液制成1%琼脂液，冷至55℃左右制板。（3）打孔：孔径3mm，孔距10mm，打孔形式如下：（4）加样：（5）搭桥：2－3层滤纸。（6）电泳：电流2-3mA/cm（琼脂板宽度，与电泳方向垂直）或电压3-4v/cm（琼脂板长度，电泳方向，包括两侧　　液面上电桥长度） 五、对流免疫电泳3、结果观察：一般30分钟-2小时观察结果，在抗原抗体两孔之间任何部位出现沉淀线均可判为阳性，如抗原浓度大于抗体，沉淀线靠近抗体孔，抗原浓度过大时，沉淀线出现在抗体孔边缘呈“八字胡”状，甚至可超越抗体孔或出现在上下两抗体孔之间，有时抗原过剩，不出现沉淀线，造成假阳性，或产生特殊沉淀线，可稀释抗原，或在湿盒中自由扩散一段时间。 对流免疫电泳图示 六、火箭免疫电泳原理：在pH8.2作电泳时，IgG基本不泳动，在琼脂中混入抗血清，浇板后在电泳阴极侧打孔，加入抗原，电泳时，抗原在含定量抗体的琼脂中向阳极泳动，形成梯度浓度，在适当区域形成如火箭的沉淀峰。因峰的高度与抗原含量成正比，故用于样品中抗原含量测定。 火箭免疫电泳图示 第五节荧光抗体技术一、原理：将具有荧光特性的荧光材料联接到提纯的抗体分子上，制成荧光抗体，荧光抗体同样保持特异性结合抗原的能力，当抗原与荧光抗体结合，在荧光显微镜下观察，即可对待检的抗原进行定性和定位，常用的荧光材料是异硫氰酸荧光素（FITC）。 2、荧光抗体检查法（1）直接法：常用于检测病变组织中病毒抗原。病理组织冰冻切片或触片，自然干燥，冷丙酮固定15分钟，加荧光抗体，37℃30-60分钟，PBS冲洗，加一滴pH9.0缓冲甘油，封片，显微镜观察，有相应抗原的部位显黄绿色荧光，同时设正常组织（Ag-）对照，未标记荧光的抗体对照，均应不显荧光。 （2）间接法Ag+Ab+37℃30-60分钟　　荧光抗体镜检　　封片　　冲洗37℃30-60分钟优点：荧光亮度更强，检出率更高，制备一种荧光抗抗体，即可用该种动物的各种抗原检测。缺点：非特异性增强。 荧光抗体技术图示 （3）荧光补体法AgAb+荧光补体优点：制备一种荧光抗体，可用于各　　　　种AgAb系统检测。缺点：非特异性较弱。 （4）抗补体法AgAb+补体　荧光抗补体抗体优点：只制备一种荧光抗体，即可用　　　　于各种AgAb系统检测。缺点：非特异性更强。 第六节酶标抗体技术1、原理：将特定的酶联接于抗体分子上，制成酶标抗体，抗原抗体特异性结合，并通过酶对底物的高效催化作用而显色，从而对抗原（抗体）进行定性，定位，定量。常用酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 2、酶标抗体染色法常用于抗原的定性、定位。病理组织经冰冻切片或石蜡切片后，用直接法（Ag+酶标Ab）或间接法（Ag+Ab+酶标抗Ab）染色，加底物显色。本法优点是不需特殊的荧光显微镜设备，且标本可长期保存。 3.ELISA（EnzymeLinkedimmunosorlentassay）即酶联免疫吸附实验。是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色。底物显色后肉眼或酶联免疫测定仪判定结果的一种方法。因本法特异性高，敏感性强，不需特殊设备。一次可检测大批标品，48小时出结果。因此是当前发展最快，应用最广的一项新技术。 （1）固相载体目前常用的是聚苯乙烯微孔型塑料板。新板无需处理即可应用，一般一次性使用。 （2）Ag或Ab的包被A、抗原抗体吸附时特性大多数蛋白质可以吸附于载体的表面，但各种蛋白质吸附能力不同。一种蛋白质能否吸附或吸附力大小须通过实验才能确定，一般病毒糖蛋白，细菌脂多糖，脂蛋白，变性DNA，免疫球蛋白易于吸附，较大的病毒，细菌或寄生虫难以吸附，须用超声波打碎或化学方法提取抗原成分，才能吸附。为了避免非特异性反应，包被用的抗原或抗体必须高度纯化，抗体最好用亲和层析或DEAE纤维素提纯，抗原用密度梯度离心法提纯。B、包被液配制及抗原或抗体稀释：抗原或抗体在最适浓度时吸附能力最强，故应选择最适包被浓度，一般用pH9.60.1M缓冲液稀释，因pH高、低离子浓度缓冲液利于蛋白质吸附。C、包被条件：包被用的抗原或抗体稀释后，0.1ml/孔，一般4℃过夜，或37℃2小时，后4℃过夜。 （3）封闭因抗原或抗体虽在最适浓度时吸附力最强，但仍不能将聚乙烯极的邻表面掩盖完，存在或多或少的孔隙，后者加入的抗原或抗体会再吸附上去，引起非特异性反应，一般将包被极取出，洗涤后，加入0.5%牛血清白蛋白或1%小牛血清封闭残存的孔隙，0.1ml/孔，37℃2小时。 （4）洗涤在ELISA过程中，每一步作用完毕，进行下一步之前，均须多次洗涤，以防止重叠反应，引起非特异现象，常用洗涤液是0.05%吐温-20PBS，一般洗涤前，将孔内液体吸干，加洗涤液于各孔至满，3-5分钟倒空，如此再洗涤两次，最后用滤纸吸干，进行下一步。 （5）ELISA实验方法A、间接法：用于测定未知抗体。B、双抗体夹心法：用于测定大分子抗　　原。D、夹心间接法：用于测定多种大分子　　抗原。C、竞争法：用于测定小分子抗原。 ELISA实验方法图示