妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的分析的论文

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时间:2018-05-07

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1、妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的分析的论文【关键词】妊娠  人类妊娠是一个复杂而又需机体各部分协调运转的过程。子宫肌层由静息到收缩的机制很复杂,目前还在探索中。妊娠期众多激素的变化引起人们广泛的关注,其中促肾上腺皮质激素释放激素(crh)近年来成为人们关注的焦点。  crh是脑肠肽家族中的一种,于1955年最早发现于下丘脑室旁核,之后在许多外周组织中,如免疫和炎症细胞、心脏、骨骼肌、甲状腺、皮肤、生育组织中发现了它的存在[1~3]。胎盘是妊娠期母体crh的主要来源。人们发现母体血浆crh水平随着妊娠

2、继续而逐渐升高,分娩前达到高峰,产后迅速下降;早产患者的crh峰较正常妇女提前,提示母体血浆crh水平与分娩密切相关[4]。crh可能通过与雌激素、肾上腺皮质激素、前列腺素和缩宫素等的相互作用,建立分娩启动的正反馈环[2,5]。在妊娠子宫宫底部crh发挥收缩作用,而在下段舒张子宫平滑肌,这可能与受体和(或)传导通路不同有关[6,7]。本研究通过对子宫下段平滑肌层中crh受体和(或)亚型的研究,进一步揭示crh在分娩过程中的作用机制。  1对象与方法  1.1研究对象(1)宫缩组:随机抽取足月因产科因素行剖宫产

3、、已有宫缩者,排除合并恶性肿瘤者,共15例,平均27.55(24~36)岁。(2)无宫缩组:随机抽取足月因产科因素行剖宫产、无宫缩者,排除合并恶性肿瘤者,共14例,平均30.64(25~41)岁。(3)未妊娠组:随机抽取因子宫肌瘤行子宫切除患者,排除合并恶性肿瘤者,共15例,平均46.59(40~54)岁。.  1.2主要试剂与仪器无水乙醇(上海试剂一厂),三氯甲烷、异丙醇(中国医药上海化学试剂公司),焦炭酸二乙酯(depc)、trizol(上海华舜生物公司),dntp、oligo(dt)(上海生工生物工程有

4、限公司),m-mlv反转录酶、tapdna聚合酶(promega公司),核糖核酸酶抑制剂(takara公司),milli-q纯水制备装置(millipore公司),pcr仪(eppendorf公司),dna电泳槽(l加depc1ml,37℃摇动过夜,然后高压灭菌。(2)75%酒精:125mldepch2o加375ml无水乙醇,混匀至终体积500ml。(3)50×tae电泳缓冲液:tris242g、100ml0.5mol/ledta(ph=0.8),加冰醋酸57.1ml,用蒸馏水定容至1000ml,临用前按需用

5、蒸馏水稀释成1倍的工作液。  1.4研究方法  1.4.1子宫标本的收集(1)于子宫下段切口正中上缘切取适量新鲜子宫肌层标本放入经过depc水处理的10ml离心管(冰中)内;(2)每个离心管内加入2mltrizol;(3)于1h内用电动匀浆机匀浆(冰浴中操作),26000rpm持续15s以彻底裂解组织;匀浆液于-80℃保存,待提取rna。  1.4.2总rna的提取及浓度测定(1)总rna的提取:按照上海华舜生物公司trizolreagent操作说明书进行。①室温溶解组织匀浆液:将组织匀浆液1ml移至1.5m

6、l离心管,室温静置8min;②各管加入0.2ml三氯甲烷;③用力颠倒混匀,室温静置8min;④4℃,12000×g离心15min;⑤将上清液小心移至另一个1.5ml离心管;⑥各管加入等体积异丙醇,振荡,室温静置10min;⑦4℃,7500×g离心15min;⑧小心弃上清液,各管加入75%乙醇1ml;⑨充分洗涤,4℃下7500×g离心10min;⑩弃上清液,空气中干燥15~20min;各管加入20μldepch2o溶解rna。(2)总rna纯度和浓度测定:采用紫外分光光度法,测定rna样品在波长260nm和28

7、0nm的紫外吸收值。根据od260为1时相当于rna40μg/ml确定rna的量,根据od260/od280的比值来判断rna样品的纯度,比值位于1.8~2.0之间视为rna纯度优良。总rna抽提后,行rna甲醛变性凝胶电泳,观察18s、28srna的完整性及二者比例,来判断rna的完整性。  1.4.3rtpcr方法(1)反转录(reversetranscription,rt):按照promega公司反转录酶mmlv操作说明书合成cdna第一链:①取2μg总rna和1μgoligo(dt)分别放入同一个1.

8、5ml离心管中;②70℃水浴5min;③冰上急冷3min;④各管分别加入10mmdntp1.25μl、mmlv1μl、rna酶抑制剂0.75μl、反转录缓冲液5μl;⑤用depch2o补齐至总体积为25μl,震荡、混匀后,离心;⑥42℃水浴60min;⑦70℃水浴15min;⑧-20℃保存备用。(2)pcr反应:利用pcr引物序列crhr1α(sense:5tccgctacaataccaacaa,a

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