灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体的制备和再生研究

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1、灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体的制备和再生研究【摘要】目的：建立贵阳腐霉原生质体的制备和再生系统，为该菌的基因工程和细胞工程改良提供适宜的真菌状态。方法：对影响原生质体形成的各因素，包括菌龄、消化酶的种类和比例、消化时间以及渗透压稳定剂的成分和浓度进行实验比较。结果：以1%纤维素酶与1%溶壁酶1∶1组合联合脱壁，0.6mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂，酶解采用KPYG2培养基培养52～54h的贵阳腐霉菌菌丝，消化5h所获得的原生质体数最多，原生质体浓度可达到6.48×106个/ml；在0.6mol/L甘露醇

2、作渗透压稳定剂的KPYG2培养基上，原生质体再生率为0.043%。结论：本实验所总结的原生质体制备方法可以获得在基因转化或细胞突变诱导所需的原生质体浓度。【关键词】真菌；贵阳腐霉；原生质体；生物灭蚊；渗透压［Abstract］Objective:Toprovideasuitablefungalmaterialforprotoplast-mediatedgeictransformationandmutationinductionofPythiumguiyangenseSu.Methods:Conditi

3、onsforthefungalprotoplastpreparationandregenerationincludingmyceliumincubationtime,variouspoundingofenzymesandosmoticstabilizersined.Results:Undertheconditionsasfolloixtureof1%lyeand1%cellulose（1:1）asdigestiveenzymesolution;0.6mol/LD-Mannitolasosmoticst

4、abilizer,and5h,ofdigestivetimetheobtainedprotoplastamountreached6.48×106eachmilliliter.Aregenerationrateof0.043%developedinthisresearch.［KeyguiyangenseSu;protoplasts;mosquitobiocontrol;osmoticpressure丝状真菌贵阳腐霉（PythiumguiyangenseSu）具有灭蚊能力强，繁殖能力快，易于人工培养以及对

5、其他非靶生物相对安全等优点［1］，具有良好的开发前景，但同时也存在着杀虫速度慢，毒力不稳定等缺点，利用基因工程技术和细胞工程技术对该菌株进行改良势在必行，而制备贵阳腐霉的原生质体是重要的基础工作之一。由于不同真菌的细胞壁的成分和结构不一样，其原生质体制备和再生所需要的条件也不一样，需要作大量的实验来总结和筛选适合某一特定真菌的制备条件。2007年5～12月对贵阳腐霉原生质体的制备和再生进行研究，报道如下。1材料与方法1.1菌株取自贵阳医学院蚊虫生物防治实验室。菌丝在固体培养基上每7d转种1次，培养温度

6、（25±1）℃。1.2培养基菌丝培养液（KPYG2）：葡萄糖1.5g/L，酵母1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，氯化钙0.075g/L，胆固醇0.02g/L，玉米油10g/L。菌丝固体培养基：KPYG2加入琼脂粉10g/L。再生培养基：用渗透压稳定剂溶解KPYG2各成分，上层含琼脂0.6%，下层含琼脂2%。1.3渗透压稳定剂氯化钠、硫酸镁为分析纯，山梨醇、甘露醇为生化试剂。1.4酶的种类及酶液的配制纤维素酶（Cellulase）为中科院上海生化所东风生化技术公司产品，溶壁酶（Lye）为广东省微生物研究

7、所产品。酶液的配制及除菌采用渗透压稳定剂配制所需浓度酶液，然后用0.22μm的微孔滤膜除菌，4℃保存备用。1.5真菌培养条件取固体培养基琼脂块1cm×1cm（长有菌丝）置于KPYG2中，110r/min离心，温度（25±1）℃，培养48～72h。1.6原生质体的制备取菌丝约0.1g于1.5mlEp管中，ddH2O洗涤两次、渗透压稳定剂洗涤一次后，加入1ml酶液，于37℃恒温摇床上110r/min进行酶解。每隔30min于显微镜下观察一次原生质体的数量。最终酶解混合液经4层擦镜纸过滤到新的1.5mlEp

8、管中，滤去菌丝残片。滤液于2000r/min离心4min，原生质体悬于上层，用渗透压稳定剂洗涤3次。以上均为无菌操作，用血细胞计数板计数原生质体。1.7原生质体的再生取渗透压稳定剂重悬的原生质体涂布于下层固体再生培养基上，再加40～50℃上层琼脂培养基3ml，迅速摇匀，（25±1）℃温育培养，形成的菌落数为（A）。另取原生质体悬液加10倍无菌蒸馏水，使原生质体破裂，再用同样方法做对照，形成的菌落数为（B）。显微镜下观察总原生质体数为（C）。3～5d后数菌