抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

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1、抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用：唐文心,王建和,陈正望,陈孝平【摘要】　　目的:制备抗硫氧还蛋白1（TRX1）的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析,用r）约为12000,属于进化保守的氧化还原蛋白家族,具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys),它与TRX1还原酶和NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的巯基氧化还原系统（TRX系统

2、）。1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今［1］,被证实广泛存在于原核、真核生物中,具有多种重要功能,如抑制细胞凋亡、增加转录因子活性,刺激细胞增殖及血管生成,作为DNA合成的辅助因子［2］。临床研究发现,在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、类风湿性关节炎、Sjogren’s综合症、急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等,患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是,许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达,包括肺癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、淋巴癌等［3］,故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新靶点,具有潜在的应

3、用价值。　　1材料和方法　　1.1材料表达载体pET32a,pcDNA3.1(+)大肠杆菌DH5α和BL21,人乳腺癌细胞MCF7细胞株由本实验室保存。MMLV反转录酶,DNA限制性内切酶,T4DNAligase,KlenoAb）、微管蛋白（βtublin）及其mAb、牛血清白蛋白（BSA）、BCA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为GibcoBRL公司产品。4～6周龄雌性BALB/c小鼠（体质量18～22g）购自湖北省实验动物研究中心。Sp2/0细胞由中国农业大学传染病与微生物学教研室提供。酶联免疫检测仪为Labsystemsdragon公司产品。Se

4、phadexG25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1TRX1的原核表达及纯化由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物对:P15′CGGAATTCAATGAACGGCCCTGAAGATCT3′;P25′CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3′。提取人乳腺癌细胞MCF7总RNA,用MMLV反转录成cDNA,以此cDNA为模板,P1和P2作为引物,用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增,反应程序为:94℃30s,55℃60s,72℃40s,循环3

5、0次。其产物和pcDNA3.1(+)载体连接得到pcDNATRX1。使用KpnI和XhoI将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的相同位点中,得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌BL21工程菌,以单菌落接种于LB培养基（含氨比西林50mg/L）中振荡培养过夜,1%转接后继续振荡培养至A值为0.5,加0.4mmol/LIPTG诱导表达。将BL21重悬于预冷的Tris缓冲液（pH7.9,含5mmol/L咪唑,0.5mol/LNaCl和20mmol/LTrisHCl）中,加入10g/LTriton

6、X100后超声破碎,12000g,10min离心后取上清。将超声后的上清以15mL/h的速度过Ni亲和柱,再用20倍柱床体积的PBS（含0.5mL/LTbin蛋白酶于22℃轻柔振荡16h,用8mL的PBS洗脱,收集洗脱液。再用100mmol/L咪唑洗脱标签蛋白。　　1.2.2免疫原BSATRX1的制备参考文献［4］,将10mgBSA溶于0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CB,pH9.0,含9g/LNaCl和1g/LSDS)中,加入2.5g/L戊二醛水溶液20μL,避光反应1h。反应液流经SephadexG25凝胶柱以除去未反应的戊二醛,0.1mol/LpH9.0的CB洗脱,收

7、集蛋白洗脱峰。在洗脱液中加入2mgTRX1,避光反应16h后,加入终浓度为1mol/L的甘氨酸终止反应6h。将反应液放入截流Mr为3000的透析袋中,于0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）中透析24h,每3～4h换液1次,最后用BCA法测定蛋白浓度,冻干,-20℃保存。　　1.2.3杂交瘤细胞建立和腹水制备及抗体纯化将BSATRX1加弗氏完全佐剂乳化后,经背部皮下多点注射BALB/c小鼠,100μg/只。免疫后第28、40及第52天,将BSATRX1与弗氏不完全佐剂乳化后,以上