基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化

《基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化　　EstablishmentandOptimizationofDotBlotTechnique　　Abstract:ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.Methods13正向、反向引物进行克隆PCR，M13ForM的EDTA对比稀释，使成0．4NNaOH和10mM的EDTA的终浓度。　　1.2.1.2把稀释的pp　　GalNAcT2的cDNA片段在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。　　1.2.1.3膜(购

2、自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干。　　1.2.1.4每点2μl把ppGalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯F照2min，取出让膜干燥。　　1.2.1.5杂交时以2×SSC浸膜5min，装入杂交袋，根据VECTORNIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。以每100cm2膜加20ml的预杂交液(50％的去离子甲酰胺，5XSSC，0．1％SDS，0．1％BSA，0．1％PVP，用pH7．5的PB调终体积)于42℃预杂交2h~3h。　　1.2.1.6弃去预杂交液，在杂

3、交液(50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0．1％SDS，0．1％BSA，0.1％PVP，10％的硫酸葡聚糖，100μg／ml的剪切的鲑鱼精DNA，用水调终体积)中加入适量探针，以每100cm2膜加10m1的杂交液于42℃杂交过夜。　　1.2.1.7用足量洗涤液1(2×SSC，0．1％SDS)于42℃洗涤二次，再用洗涤液2(0．5×SSC，0．1％SDS)于55℃严谨洗涤二次。　　1.2.1.8用蒸馏水淋洗膜2min~5min，然后用封闭液(不同浓度的BSA,0．1MNaCl，0．2％Triton100，0．1MTris，p

4、H7．5)封闭。　　1.2.1.9倒出封闭液，加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素　　1.2.1.11显色结束后以TE终止，用扫描仪获取图像。　　1．2．2斑点杂交建立及优化程序　　1．2．2．1尼龙膜上不点任何样品，以下述条件行假杂交反应　　杂交液中探针的终浓度为：200ng／ml、100ng／ml、50ng／ml、10ng／ml；酶的稀释比例为：1／400、1／800、1／2000、1／5000；封闭液中BSA的终浓度为：2％，封闭2h;杂交后洗涤液1和2分别洗二次，每次1h;封闭后洗涤液洗二次，每次1h；检测缓冲液

5、平衡1h；显色30min。　　1．2．2．2以1．2．2．1所获得的最佳本底，在尼龙膜上点上ppGalNAcT2的cDNA片段，其余条件不变，封闭液中BSA的浓度设计成2％、3％和5％三梯度进行杂交反应。　　1．2．2．3以1．2．2．2所获得的最佳条件，改进以下条件　　杂交后洗涤时间、每次1h、每次30min、每次10min；封闭液封闭时间：2h、1．5h、50min；封闭后洗涤时间、每次1h、每次40min、每次20min；检测缓冲液平衡时间：1h、30min、10min；显色以出现清晰的阳性信号，本底最低为尺度，一般

6、在15min左右，时间延长本底升高。　　1．3斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp　　GalNAcT2的表达差异NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所；RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUCMixDNAmarker和ladder购自lnvitrogen公司，随机引物购自Takara公司。β微球蛋白(内对照)引物采用Geyx软件设计，并经OenBankBlast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。　　βMG引物序列为：F：

7、5’CTCGTGCTACTCTCTCTTTC3’R：5’CATGTCTCGATCCCACTTAAC3’预期扩增产物长度330bp。ppGalNAcT2引物为：F：5’GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC3’R：5’CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC3’预期扩增产物长度为668bp。　　采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株RNA，测A260／A280比值和电泳图谱鉴定抽提完整性，测A260定量，六随机引物逆转录制作cDNA。倍比稀释点膜，用ppGalNAcT2特异

8、的寡核苷酸探针与膜杂交：同时以上述获得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株cDNA加ppGalNAcT2和βMC正反向引物行RTPCR来验证斑点杂交结果。　　2结果　　2.1尼龙膜上不占任何样品所进行的假杂交反应结果如图1所示，可见以杂交液中探针的终浓度为10ng/ml,酶的稀释比例为