建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化

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1、建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化【关键词】毛细胞；前庭；器官培养技术；佛波醇酯类　　在现代医学和生物学研究中已广泛应用了组织培养技术，它具有在体内研究中无法比拟的优点.体外培养模型的建立克服了在体内研究中无法解决的难题，应用体外培养技术可拓宽内耳研究的范围，为研究耳聋细胞学的机制和治疗提供一个模型系统，并使体外条件下内耳的病理、生理及药理学研究能得以深入进行［1-3］.我们在建立体外前庭器官培养模型的基础上，采用透射电镜技术观察在蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）活化剂佛波酯(phorbolmyristateacetate,PMA)诱导后的前庭

2、上皮细胞超微结构的改变.　　1材料和方法　　1.1材料　　新生2d的SD大鼠20只，雌雄不限，体质量(7.3±1.3)g，（第四军医大学实验动物中心）；Dulbecco改良细胞培养基（dulbeccosmodifiedeaglesmedium,DMEM），HEPES，PMA（美国Sigma公司）；Hank液按配方配制［4］；SZ40型解剖显微镜，IX7型倒置显微镜（Olympus公司）；37℃培养箱（美国SHELLAB公司）；显微手术器械1套、超净工作台等；ULTRACUTUC6型超薄切片机（德国Leica公司）.DMEM的配制：25mmol/LHEPES，100mL/L灭活的胎牛

3、血清，1×105U/L青霉素.自制鼠尾胶原：取大鼠鼠尾一根，750mL/L乙醇浸泡30min，在无菌条件下抽取肌腱，置于平皿中，取1.5g剪碎肌腱浸予已灭菌的20mmol/L醋酸溶液150mL中，4℃冰箱放置并断续摇动，48h后移入无菌离心管，4000r/min离心30min，吸取上清液，10磅10min高压灭菌后分装小瓶，-20℃冰箱保存.培养前1d包被培养板.Hank液配制按文献［4］的方法逐步加入各成分，高压蒸气灭菌后pH值调节至7.2～7.4.　　1.2方法　　1.2.1体外前庭器官培养模型的建立　　按照Lambert的方法［5］，取新生2d大鼠，-20℃冰箱冷冻麻醉5min后全

4、身浸入750mL/L乙醇5min，无菌条件下断头，置于冰的Hank液中，在解剖显微镜下取出椭圆囊，打开囊壁，去除耳石，用吸管悬滴将椭圆囊移入鼠尾胶包被过的24孔培养板中央，放于37℃，50mL/LCO2培养箱，待组织贴壁后加入适量DMEM高糖培养液，置于培养箱中培养.每日于倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日将原液吸出，加入等量培养液.培养至1，3，5和7d取出固定，透射电镜观察.　　1.2.2实验分组　　将新生2d大鼠10只分为实验组及对照组，每组5只.无菌条件下取材后培养过夜，实验组加入含PMA（1.6×10-4mmol/L）的培养液，培养30min，2h和6h后，戊二醛固定

5、.　　1.2.3电镜标本制备　　椭圆囊斑置于40mL/L戊二醛液固定12h，然后依次进行锇酸后固定、丙酮梯度脱水、丙酮及环氧树酯浸透包埋步骤，超薄切片机行超薄切片，厚70nm.醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染，JEM2000EX透射电镜观察并照相.　　2结果　　2.1前庭器官体外培养模型的建立　　培养物在未被污染的培养液中培养7d，培养液无混浊，但色泽由橘红渐变黄，倒置显微镜下观察培养物呈半透明状，色泽无发黑，置入培养板中30min贴壁，加液无飘浮，12h可见梭形成纤维样细胞生长（图1A），24h可见内皮细胞生长并呈铺路石样增长（图1B）；实验组培养物与对照组无明显区别.　　2.2电镜结果　　

6、对照组在1～5d的超微结构无明显差别，毛细胞生长良好，可见表皮板、纤毛，胞膜完整，核膜无消失，核染色质无浓缩、边集，线粒体、高尔基体、内质网均正常（图2A）.7d毛细胞形态稍不规则，但纤毛胞膜完整，胞内细胞器无明显改变；实验组毛细胞纤毛排列整齐，胞膜、核膜无明显改变，核染色质无浓缩、边集，核糖体密集，高尔基体较前发达，内质网轻度扩张（图2B，C），各培养时间段细胞间无明显变化.　　　　PMA是一种从东南亚巴豆的种子中发现的佛波醇酯衍生物，在细胞内不易降解，在体内和体外都可以直接激活PKC，在研究不同种类细胞的生长和分化以及细胞周期的调节上被广泛应用.应用PMA可使血管平滑肌收缩持续数小时

7、，且在Ca2+浓度恒定时仍能介导血管平滑肌持续收缩［6］.PMA对细胞间隙连接通讯具有抑制作用，其主要机制是经PKC介导的致连接蛋白过磷酸化，同时发现PMA可通过影响钙依赖性细胞粘附分子的功能及调控连接蛋白的基因的表达而抑制细胞的间隙连接通讯.致敏肥大细胞在PMA作用下，PKC的活化可调节酪氨酸蛋白激酶活性，并上调cfos,cjunmRNA的表达［7］.PMA是PKC的强激活剂，有关研究表明：PMA可以刺激心肌细胞、SE细胞增殖