建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的

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1、建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的【摘要】目的：建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型，并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化.方法：无菌条件下取出生2d大鼠的椭圆囊上皮，体外培养1～7d；从第2日开始用倒置显微镜观察、照相，试验组加入PMA30min，2h和6h，固定,透射电镜观察.结果：体外培养椭圆囊1yristateacetate,PMA)诱导后的前庭上皮细胞超微结构的改变.　　1材料和方法　　1.1材料　　新生2d的SD大鼠20只，雌雄不限，体质量(7.3±1.3)g，（第四军医大学实验动物中心）；Dulbecco改良细胞培养基（dulbe

2、ccosmodifiedeaglesmedium,DMEM），HEPES，PMA（美国Sigma公司）；Hank液按配方配制［4］；SZ40型解剖显微镜，IX7型倒置显微镜（Olympus公司）；37℃培养箱（美国SHELLAB公司）；显微手术器械1套、超净工作台等；ULTRACUTUC6型超薄切片机（德国Leica公司）.DMEM的配制：25mmol/LHEPES，100mL/L灭活的胎牛血清，1×105U/L青霉素.自制鼠尾胶原：取大鼠鼠尾一根，750mL/L乙醇浸泡30min，在无菌条件下抽取肌腱，置于平皿中，取1.5g剪碎肌腱浸予已灭菌的20mmol/L醋酸溶液150mL中，

3、4℃冰箱放置并断续摇动，48h后移入无菌离心管，4000r/min离心30min，吸取上清液，10磅10min高压灭菌后分装小瓶，-20℃冰箱保存.培养前1d包被培养板.Hank液配制按文献［4］的方法逐步加入各成分，高压蒸气灭菌后pH值调节至7.2～7.4.　　1.2方法　　1.2.1体外前庭器官培养模型的建立　　按照Lambert的方法［5］，取新生2d大鼠，-20℃冰箱冷冻麻醉5min后全身浸入750mL/L乙醇5min，无菌条件下断头，置于冰的Hank液中，在解剖显微镜下取出椭圆囊，打开囊壁，去除耳石，用吸管悬滴将椭圆囊移入鼠尾胶包被过的24孔培养板中央，放于37℃，50mL/LC

4、O2培养箱，待组织贴壁后加入适量DMEM高糖培养液，置于培养箱中培养.每日于倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日将原液吸出，加入等量培养液.培养至1，3，5和7d取出固定，透射电镜观察.　　1.2.2实验分组　　将新生2d大鼠10只分为实验组及对照组，每组5只.无菌条件下取材后培养过夜，实验组加入含PMA（1.6×10-4mmol/L）的培养液，培养30min，2h和6h后，戊二醛固定.　　1.2.3电镜标本制备　　椭圆囊斑置于40mL/L戊二醛液固定12h，然后依次进行锇酸后固定、丙酮梯度脱水、丙酮及环氧树酯浸透包埋步骤，超薄切片机行超薄切片，厚70nm.醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染

5、，JEM2000EX透射电镜观察并照相.　　2结果　　2.1前庭器官体外培养模型的建立　　培养物在未被污染的培养液中培养7d，培养液无混浊，但色泽由橘红渐变黄，倒置显微镜下观察培养物呈半透明状，色泽无发黑，置入培养板中30min贴壁，加液无飘浮，12h可见梭形成纤维样细胞生长（图1A），24h可见内皮细胞生长并呈铺路石样增长（图1B）；实验组培养物与对照组无明显区别.　　2.2电镜结果　　对照组在1～5d的超微结构无明显差别，毛细胞生长良好，可见表皮板、纤毛，胞膜完整，核膜无消失，核染色质无浓缩、边集，线粒体、高尔基体、内质网均正常（图2A）.7d毛细胞形态稍不规则，但纤毛胞膜完整，胞内

6、细胞器无明显改变；实验组毛细胞纤毛排列整齐，胞膜、核膜无明显改变，核染色质无浓缩、边集，核糖体密集，高尔基体较前发达，内质网轻度扩张（图2B，C），各培养时间段细胞间无明显变化.　　3讨论　　器官培养是把器官原基、器官的一部分或整个器官放入近似体内环境的培养系统中，保持原有组织间的三维结构和分化程度，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法.首例成功的听泡培养是Fell在1928年完成的，为内耳感觉上皮体外培养奠定基础.在内耳培养中，DMEM和MEM培养基应用较多，DMEM主要用于神经组织和无血清培养.本试验采用DMEM培养基，组织生长良好.Oesterle比较悬浮培养法、旋转培养法、凝块

7、培养法培养内耳器官的效果，提示贴壁是保证内耳器官生存的关键.哺乳动物感受器官在体外存活、生长的难度较大，成年动物组织不易成活，新生鼠内耳周围骨组织出生时柔软且薄，第2日稍硬，很容易剥离，第3日开始骨化，易破碎，解剖最易.　　　　PMA是一种从东南亚巴豆的种子中发现的佛波醇酯衍生物，在细胞内不易降解，在体内和体外都可以直接激活PKC，在研究不同种类细胞的生长和分化以及细胞周期的调节上被广泛应用.应用PMA可使血管平滑肌收缩