异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒检测的探讨

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1、异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒检测的探讨作者：张琳周健张子宽宋永平【摘要】目的探讨异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后巨细胞病毒(CMV)活动性感染的有效检测方法。方法分别应用普通PCR、巢式PCR、流式细胞仪同步检测13例alloHSCT后患者117份外周血标本的CMVDNA和pp65抗原。结果普通PCR检测阳性率为44.4%，巢式PCR检测阳性率为24.8%，流式细胞仪检测阳性率为30.8%。临床活动性感染率为27.4%。普通PCR检测阳性率与临床活动性感染率之间无明显相关性(r=0.207，P＞0.05)。巢式PCR和流式细胞仪的阳性检出率之间的差异无统计学意义

2、(P＞0.05)，它们和临床活动性感染有明显的相关性(r分别为0.518和0.529，P＜0.05)。结论巢式PCR检测CMVDNA和流式细胞仪检测pp65抗原可用于alloHSCT后CMV活动性感染的诊断。【关键词】异基因造血干细胞移植术；巨细胞病毒；PCR近年来异基因造血干细胞移植(alloHSCT)已成为治疗恶性血液病、再生障碍性贫血、某些实体肿瘤的一种有效的手段。alloHSCT后早期白细胞虽然数量上已重建，但机体免疫系统功能尚未恢复，尤其是细胞免疫功能远未重建，细胞免疫功能缺陷可使体内潜伏的或经输血或供者细胞获得的人类巨细胞病毒(humancvtome~alovi

3、rus，hCMV)复燃，引起CMV活动性感染［1］。CMV活动性感染的主要类型是巨细胞病毒间质性肺炎，是alloHSCT后的主要并发症，病死率高达70%～90%。因此CMV活动性感染和CMV间质性肺炎是导致移植失败重要原因之一［2］。虽然更昔洛韦的使用使CMV疾病的治疗有了较大转机，但取得抗CMV显著疗效的切入点还是在于早期诊断和及时治疗。由于CMV多引起潜伏感染，而且早期所致疾病的临床表现多为非特异性，其诊断主要依靠实验室检查［3］。目前诊断方法多种多样，但哪种方法能更简便、快速、灵敏可靠地早期检测出CMV，存在很大争议。本研究应用普通PCR和巢式PCR检测CMVDNA，流式

4、细胞仪(FCM)检测CMVpp65抗原，旨在探讨CMV感染的早期有效诊断方法。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂淋巴细胞分离液，中国医学科学院血液学研究所生产；Taq酶、10×PCR反应缓冲液、dNTP、蛋白酶K，北京华美生物工程公司生产；引物由大连宝生物有限公司合成；小鼠IgG1抗原由北京中山生物技术有限公司提供；溶血素，BeckmanCoulter公司；细胞穿孔剂、CMVpp65C10/C11抗体、FITC标记的羊抗鼠IgGl抗体，美国IQ公司；其他试剂均为国产分析纯。1.1.2仪器DNA扩增仪4800型，美国PE公司产；高速低温台式离心机MRL822型，法国产；凝胶成

5、像分析仪GDS80型，美国产；流式细胞仪(FCM)EPICSXL型，BeckmanCoulter公司产。1.1.3检测对象2003年1月～2004年2月在河南省肿瘤医院血液科行异基因造血干细胞移植术患者13例，男9例，女4例，中位年龄33(3～46)岁。慢性粒细胞白血病6例(慢性期4例，加速期1例，急变期1例，后者为同基因造血干细胞移植术后复发急单变)，非何杰金氏淋巴瘤1例，急性髓系白血病4例(AMLM22例，AMLM11例，AMLM51例)，急性淋巴细胞白血病1例，重型再生障碍性贫血1例。HLA相合同胞造血干细胞移植7例，非血缘关系造血干细胞移植2例，单倍型造血干细胞移

6、植3例，非亲缘脐血干细胞移植1例。术前常规检测受者IgG、IgM抗体，排除IgM抗体阳性移植患者，血液成分输注均采用60Co照射。于回输当天、造血恢复后每10d左右采集外周血1次，共采集标本117份。1.2方法1.2.1普通PCR和巢式PCR检测CMVDNA①单个核细胞(MNC)的分离及总DNA提取：取外周血5～8ml肝素抗凝，经淋巴细胞分离液(相对密度1.077)15000rpm，取界面层MNC，PBS洗涤2次，备用；②PCR模板制备，取MNC用美国Gibco公司提供的Trizol一步法直接提取DNA，紫外分光光度计测DNA量；阳性对照模板为CMVADl69株DNA;用正常人外

7、周血MNC作为质量控制，用作空白对照，以确保实验的正确性;③PCR扩增，取扩增产物10μl加入40μlPCR反应体系(1／10体积10×PCR反应缓冲液、dNTP200μmol/L、MgCl22.0mmol/L、TaKaRaTaq2.5IU、引物200ng)混匀；循环参数为37℃：5min；94℃：1min；95℃：5s；60℃：40s；40个循环；巢式PCR是先用一对外侧引物进行第一次扩增，然后将5μl扩增产物用内侧引物进行第二次扩增;④PCR产物分析，取PCR扩增产物15μl