小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究

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1、小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究作者：宋科瑛　王瑞涛　卢列盛　董维平　李克【摘要】　　目的：探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法，评价其功能。方法：采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛，不连续密度梯度离心法纯化胰岛，用双硫腙（Dithizone，DTZ）对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果：胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150~250个高质量胰岛，活性>95%，纯度>90%。葡萄糖及茶碱（

2、carbachol，Cch）刺激后胰岛素释放量明显增加。结论：改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法，可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。【关键词】胰岛·分离·纯化·小鼠　　Isolation，PurificationandFunctionalAssessmentofIsletsinMice【ABSTRACT】Objective:Thetechnicaldifficultyinmouseisletsisolationandpurificationrestrictsitso

3、difiedmethodice.Methods:Intraductalcollagenase-Pperfusionanduniformdistentionoftheglandicepancreas.AFicollgradientsolution（25%,23%,20%,and11%）akethepurification.Isletsulatedinsulinsecretiontest.Results:Theyieldandviabilityoftheisletsing.ice　　胰岛移植被认为是有望治愈胰岛素依赖性糖尿病（i

4、nsulin-dependentdiabetesmellitus）的新型治疗方法。小鼠品系纯正，可重复性好，可进行基因调控,自身繁殖力强，可缩短科研周期，已在国外胰岛移植和糖尿病研究领域，尤其是基因治疗领域，得到越来越广泛的应用［１-５］。但由于小鼠体积小，胰腺相关解剖结构细微，胰岛的分离纯化操作有一定的难度。本研究参考学术交流中获得的纽约西奈山医学院和美国康奈尔大学医学院的小鼠胰岛分离纯化方案，结合国内实验条件，对小鼠胰岛的分离、纯化、培养作了改进。体外功能检测证实，该方法分离纯化的小鼠胰岛可用于胰岛移植的相关后续研究。1

5、　材料与方法1.1　材料　8~12周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心,在清洁环境下喂养。NagashimaNo.5304型手术显微镜由日本永岛医疗器械株式会社制造。胶原酶-P为Roche公司产品，Ficoll-400为Pharmacia公司产品,超灵敏胰岛素ELISA试剂盒购自CrystalChemical公司，DNA酶Ⅰ购自Sigma公司，RPMI1640培养基、小牛血清和胎牛血清由GIBCO公司提供。1.2　方法1.2.1　分离液和消化液的配制　分离液（dissociationbuffer）的配

6、制：Hanks液500ml加入50mgDNA酶Ⅰ和12.5ml、1mol/L羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethylpiperazineethanesulfonicacid,HEPES），0.22μm孔径滤膜过滤，调节pH值至7.2~7.4，4℃保存。消化液的配置临用时新鲜配置，采用分离液溶解胶原酶-P，浓度为1mg/ml。1.2.2　Ficoll-400浓度梯度溶液的配制　Ficoll-400108g，加324ml分离液，配成25%Ficoll-400溶液；充分混匀后量取25%Ficoll-400溶液91.20ml用分离

7、液定容到100ml，配成23%Ficoll-400溶液；取23%Ficoll-400溶液80.52ml分离液定容到100ml，配成20%Ficoll-400溶液；取20%Ficoll-40044.12ml用分离液定容到100ml，配成11%Ficoll-400溶液。全部配制完成后0.22μm孔径滤膜过滤，液体pH值均调至7.2~7.4，4℃保存。1.2.3　小鼠胰岛的分离　1%戊巴比妥钠按照40mg/ｋg剂量对小鼠行腹腔注射麻醉。75%乙醇消毒皮肤，打开腹腔，肝脏外展暴露胰腺及胆总管，在胆总管进入十二指肠处将其夹闭。按每个胰

8、腺5ml配制胶原酶-P溶液（1g/L，4℃），置于50ml离心试管中备用。体视显微镜下采用30G规格针头穿刺胆总管，缓慢注入胶原酶-P溶液2~3ml，使溶液逆行进入胰腺导管，均匀膨胀胰腺。剪心放血处死小鼠。剪除胃与横结肠之间的大网膜及脾脏，沿十二指肠边缘自十二指肠向小肠方向剥离胰腺组织。剩