大鼠胰岛分离与纯化的实验研究论文

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1、大鼠胰岛分离与纯化的实验研究论文.freelm3的碎块，加入3mL预温的1gL-1的胶原酶（IV型，Sigma）消化液中，置38℃水浴箱中10min，将消化下来的上层细胞悬液吸出置入含小牛血清的4℃Hanks液中，终止消化.再将剩余的胰腺组织块加入2mL1gL-1胶原酶液中，重复以上实验2～3次，直到胰腺组织消化完全，将得到的胰岛细胞悬液用不锈钢丝网（80目）过滤，用4℃的Hanks液洗涤2次后，制备成2mL细胞悬液，立即准备纯化.1.2胰岛纯化采用葡聚糖间断密度梯度法，取一离心管依密度大小，依次缓慢加入密度为1.112，1.

2、091，1.083和1.044的葡聚糖液各4mL，与传统方法不同，将2mL细胞悬液缓慢加入分离液最上层，离心管加盖离心，500rmin-1离心5min，再调至2000rmin-115min，收集各界面的细胞团，分别取一定量的分离物，用双硫腙染色，观察胰岛分布情况，在倒置显微镜下作胰岛计数.1.3胰岛形态学鉴定①双硫腙染色;②碘丙啶-丫啶橙荧光染色法.1.4纯度估计用倒置显微镜下胰岛数量与外分泌组织量之比来估计.1.5生物学活性测定将纯化胰岛置于200mLL-1胎牛血清RPMI1640培养液中于37℃，950mLL-1空气、50

3、mLL-1CO2条件下培养3L）.隔天换液，测培养液中胰岛素含量24h.胰岛素测定采用放射免疫法（胰岛素试剂盒由北京北方生物技术研究所生产）.2结果大鼠胰腺分离及纯化后，用双硫腙染色阳性细胞团进行比较，平均收获量600～1200个/胰腺，平均为（1012±231）胰岛/胰腺.胰岛纯度可达90%，纯化的胰岛大部分（约90%）分布在1.112～1.091和1.091～1.083葡聚糖界面中.经胶原酶消化后的大鼠胰腺组织的悬液在倒置显微镜下观察，见有大小不一，圆形或卵圆形的细胞团和散在细胞，用双硫腙染色后染成红色或猩红色的细胞团为典

4、型胰岛，低倍镜下（10×10）观察胰岛直径大小不一，胰岛内胰岛细胞数量不等，胰岛外分泌组织不着色.碘丙啶-丫啶橙荧光染色示细胞活率90%（活细胞呈绿色，死细胞呈红色）.胰岛素生物活性测定结果显示胰岛细胞在3olS-1L-1］，3olS-1L-1］，分泌量下降与培养条件有关.3讨论胰岛的制备是胰岛移植的关键，我们的目的是制备出大量的高纯度、生物活性好的胰岛或胰岛细胞，在胰腺组织消化过程中，消化时间长不但降低胰岛细胞的活性，而且易形成一种粘稠的胶状物，它可网罗大量的胰岛，从而减少收获量;反之消化时间不够，胰岛的收获量会明显减少.因

5、此作者针对以上情况，在参考国外文献报道的基础上［1-4］，经过反复试验摸索，采取分次消化、镜下动态观察消化情况相结合的办法，严格把握消化时间，即可使组织得到充分的消化，获得最大量的收获，达到（1012±231）胰岛/胰腺.同时该法减少了胶原酶用量，省时、方便.另外，尽量使已消化析出的胰岛减少暴露在温热酶消化过程的时间，是提高胰岛活力的一个重要因素.作者在实验中，暴露时间尽量控制在10～15min，是常规消化时间的1/2，尽量使最先被消化下来的细胞避免受到消化酶的影响，作者通过用双硫腙染色法进行观察，镜下胰岛呈红色，外分泌组织不

6、着色，对比非常鲜明，显示纯度在90%以上.碘丙啶-丫啶橙荧光染色，显示胰岛活率在90%以上.该方法在胰岛分离、提纯过程中为胰岛的鉴别和计数提供了非常简便、直观的方法.同时对胰岛分泌胰岛素进行检测显示，普通培养条件下1F，SunAM.Microencapsulatedisletasbioartificialen-docrinepancreas［J］.Science，1980;210（21）:908-910.［2］LakeSP，AndersonJ，ChamberlainJetal.Bovineserumalbu-mindensit

7、y.Gradientisolationofratpancreaticislet［J］.Transplantation，1987;43（6）:805-808.［3］FieldJ，FarneyA，SutherlandERD.Improvedisletisolationfromratpancreasusing35%bovineserumalbumininbina-tionelmaeraldoR，GrayDplemethodforisolationofisletsfromtherabbitpancreas［J］.Transplan-t

8、ation，1994;58（3）:390-392.