细胞凋亡与角膜移植免疫反应关系的初步研究

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1、细胞凋亡与角膜移植免疫反应关系的初步研究作者：杨朝忠，张军，华山，吴艳蕊，祝东升，马路生【摘要】目的研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后角膜的表达情况、角膜细胞凋亡情况及其与角膜移植免疫排斥反应的关系。方法（1）对35例角膜移植手术（25例新鲜角膜、10例冷冻保存）剩余组织应用免疫组织化学SABC法分别进行Fas和FasL蛋白染色。（2）应用Tunel法对上述标本进行细胞凋亡的研究。（3）观察35例部分穿透性角膜移植免疫排斥反应发生发展情况。结果（1）角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白

2、均为细胞质和（或）细胞膜着色。角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白均呈阳性表达。角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas、FasL蛋白阳性表达量经统计学分析差异无显著性。（2）凋亡的角膜细胞均为细胞核着色。25例新鲜角膜平均每高倍视野可见凋亡细胞（1.788±0.621）个，经冷冻保存后的角膜（10例）每高倍视野可见凋亡细胞平均为（8.164±2.126）个，经统计学处理P＜0.05，差异有显著性。（3）角膜移植免疫排斥反应发生与角膜

3、的新鲜程度有关，新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后6～12个月的免疫排斥反应发生率为12%（3/25），深低温保存角膜移植后6～12个月的免疫排斥反应发生率为10%（1/10），二者差异无显著性（P＞0.05）。结论（1）新鲜和深低温保存后的角膜均可见Fas、FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质和内皮细胞均表达，FasL在角膜上皮、内皮细胞表达，而基质细胞不表达。（2）新鲜角膜可见极少量凋亡细胞，角膜经深低温冷冻保存后，凋亡细胞数量显著增加。降温-复温损伤可能与细胞凋亡有关。（3）角膜移植免疫排斥反应发生与角

4、膜的新鲜程度有一定关系，深低温保存后角膜的抗原性可能降低，不易引起免疫排斥反应的发生。【关键词】Fas蛋白；FasL蛋白；凋亡；角膜移植免疫排斥【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetalcorneaanddeepcryopreservativean.MethodsSABCimmunohistochemistrymethodbededsectionsof35cornea.Thetunel(TdTmediatedbiotindUTPnick-endlabel

5、ing，TUNEL)techniquealcorneaanddeepcryopreservativeinhuman.ResultsInallpositivecells，Fas/FasLandcellmembraneberofapoptoticcellsalcornea)and10%(cryopreservativecornea).ConclusionFasproteinandFasLligandproteinexpressedinallcorneaaayberelatedtocryopreservation-ind

6、ucedcellapoptosis.Itmayreducetherateofcorneagraftrejection.【Keym部分穿透性角膜移植，男23例(23眼)，女12例(12眼)；角膜为本院眼库提供，25例新鲜角膜，10例为深低温冷冻保存角膜。手术时将剩余角膜用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm切片。冷冻保存法采用简易二步法深低温保存［1］，冷冻时间1周～10个月，平均冷冻时间为（5.12±3.47）个月。1.2试剂及主要器械Fas、FasL蛋白染色及Tunel法细胞凋亡试剂（武汉博士德公司分装的即用型

7、试剂盒）；深低温保存角膜试剂有二甲基亚枫（DMSO），20%人血白蛋白，液氮，QL-Ⅱ型生物降温仪。1.3实验方法1.3.1Fas、FasL蛋白免疫组织化学检测方法采用即用型SABC法。阳性对照组：Fas、FasL试剂盒中自带阳性对照片作为阳性对照组；阴性对照组：用PBS代替一抗作为阴性对照组。1.3.2细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP标记法［2］（TdTmediatedbiotindUTPnick-endlabeling，TUNEL）原位标记。1.4实验结果判断1.4.1Fas

8、、FasL判断以细胞膜和（或）细胞质有清晰棕黄色颗粒着色为阳性染色细胞，细胞膜或细胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。1.4.2凋亡细胞判断以细胞核呈棕黄色着色为阳性染色细胞，胞核无棕黄色着色为阴性细胞。每张切片随机取6个视野（高倍镜下）记数，取平均值为该片凋亡细胞数。1.5统计学方法根据资料性质，分别采用完全随机设计资料的方差分析和t检验。P＜0.05为差