融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用

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1、融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用【摘要】目的：研究树突状细胞（DCs）对热休克蛋白70（HSP70）融合蛋白的内化作用.方法：首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP.实验中所用DCs来源于人外周血.内化实验分3组进行：将1，2组DCs分别与融合蛋白HSP70EGFP和蛋白EGFP孵育30min；第3组先将DCs与HSP70孵育30min，再与HSP70EGFP孵育30min.之后将3组DCs转至37℃孵箱内，培养0.5，1，2和24h，应用流式细胞仪检测含HSP70EGFP或EGFP的DCs

2、数量.应用IL12Elispot法检测HSP70EGFP等抗原促进DCs分泌IL12的效果.结果：①成功获得了重组蛋白HSP70EGFP，Mr约为97000，HSP70EGFP表达量占总蛋白的35.7%.纯化后的融合蛋白HSP70EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.②流式细胞仪检测结果显示在37℃孵育0.5h后，HSP70EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%，其余两组为阴性.在37℃孵育1，2和24h后，3组阳性率均大于80.0%.IL12Elispot检测结果显示，在刺激DCs活化及分泌IL12的水平上，HSP70EGFP与脂多糖（LPS）之间的差别

3、无统计学意义(P>0.05)，而HSP70EGFP的活化DCs能力明显高于EGFP(P=0.001).结论：①受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70EGFP的初始阶段起主要作用，随孵育时间的延续，吞饮作用占主要地位.②HSP70EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL12.【关键词】吞噬作用；受体介导；树突细胞；重组融合蛋白质类；热休克蛋白质70；绿色荧光蛋白质类　　热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发肿瘤疫苗具有重要意义.许多研究采用标记的热休克蛋白观察HSP肽复合物在抗原递呈细胞（antigenpresentingcell,APC）上的呈递过程，发

4、现APC表面存在HSP受体［1-2］.有研究发现，gp96融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞（dendriticcells，DCs）分泌IL12和TNFα，增强其抗原递呈能力［3］.而对热休克蛋白70（heatshockprotEin,HSP70）融合蛋白在抗原递呈细胞上的递呈过程的研究报道较少.我们设计了HSP70和具有示踪功能的增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescenceprotEIn,EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP，以探讨DCs内化外源性抗原的方式及不同抗原对DCs的活化效果.　　1材料和方法　　1.1材料　　新鲜全血由健康志愿者提供；质

5、粒pIRES2EGFP（美国Clontech公司）；原核表达载体pET28a(+)HSP70由第四军医大学病理学教研室陈广生博士构建；NiNTAHis.Bind树脂（美国Novagen公司产品）；rhIL4，rhIL2（美国RD生物工程公司产品）；rhGMCSF由厦门特宝生物工程公司生产；鼠抗人McAbCD1a，CD80和HLADR（美国Sigma公司）；羊抗鼠IgGFITC（武汉生物制品公司）；人IL12Elispot系统（法国DIACLONE公司产品）；蛋白HSP70，MAGE1由第四军医大学病理学教研室惠赠；蛋白EGFP的制备按　　2.5IL12酶联免疫斑点实验结

6、果　　HSP70EGFP刺激物组平均斑点数为134.09±7.05/1×105DCs细胞，明显高于灭活LPS刺激物组，平均斑点数为：（33.78±1.40/1×105DCs细胞）和EGFP刺激物组，平均斑点数为：（23.13±0.31/1×105DCs细胞）（P<0.01），与LPS刺激物组，平均斑点数为：（146.36±6.91/1×105DCs细胞）比较，差异无统计学意义(P>0.05).　　3讨论　　HSP70与不同抗原的融合蛋白作为肿瘤疫苗，具有明显的抗肿瘤免疫作用［5-8］.其原因在于HSP70具有免疫载体分子的作用，能增强与之结合抗原的抗原性，并发现HSP70融合

7、蛋白可诱导机体产生特异性CTL反应的部分主要为其N端约360aa部分［9］.本研究将EGFP连接于HSP70C端，获得重组蛋白HSP70EGFP，研究DCs对HSP70融合蛋白的内化作用.HSP70EGFP的获得，不仅保持了HSP70诱导细胞免疫活性的功能，还提供了可发出绿色荧光的EGFP，免去再标记HSP70融合蛋白的过程，为示踪DCs对HSP70融合蛋白的内化作用提供了新手段.　　　　有研究发现结构型Hsc70和