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时间:2018-05-02
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1、慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展【关键词】肝炎乙型慢性基因疗法治疗基因DNA反义RNA反义 慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染引起的、病死率较高的一种慢性传染性疾病,易发展为肝硬化、肝癌。据资料显示[1,2],全球约有3.5亿慢性乙肝患者,我国是慢性乙肝高发区,约有1.3亿患者。目前,基因治疗作为一种全新的治疗理念越来越受到人们的关注。基因治疗是指将外源性的有特定功能的目的基因(DNA或RNA片段),通过一定的技术手段导入靶细胞内,成为宿主细胞遗传物质的一
2、部分,在一定条件下目的基因表达产物对疾病起治疗作用的一种治疗方式。当前基因治疗的研究热点主要集中在探索适宜的治疗基因、构建理想的载体以及对导入基因表达的调控与监测等方面。笔者将着重从反义RNA技术、反义DNA技术、核酶技术、锁核酸与锁核酸核酶、RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术和显性阴性突变体等几个方面对基因治疗策略的现状作一综述,以期为抗HBV基因治疗研究提供参考。 1反义RNA技术 1.1反义RNA的作用机制 反义RNA(antisenseRNA)亦称反义寡核苷酸
3、(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)是指按碱基互补配对原则与单链mRNA特异性结合,形成部分双链核酸,定点封闭靶基因,阻断特定基因表达的一小段(20~30bp左右)人工合成的RNA分子,具有精确选择性和高度特异性,而且能显著抑制病毒复制,被认为是一种较理想的基因治疗药物。反义RNA可能通过以下几种反义作用机制达到抗HBV的目的:①反义RNA互补于特定的mRNA的非编码区,影响核糖体的结合,从而抑制翻译;②反义RNA互补于特定的mRNA的编码区,抑制翻译;③反义
4、RNA通过激活RNaseH,使mRNA易于被核酸酶降解;④反义RNA作用于靶mRNA的5'端,阻止帽子结构的形成,影响靶mRNA的成熟;⑤反义RNA作用于3'端的poly(A)尾的形成,阻止靶mRNA的成熟及其向胞浆内的转移;⑥反义RNA作用于外显子与内含子的连接区,阻止mRNA前体的剪接。通过以上几种机制,反义RNA可以在翻译水平阻断HBV的mRNA的表达。 1.2依不同基因位点而设的ASODN的抗HBV能力 自20世纪90年代初Goodarizi首次报道了反义RNA能特异抑制HBV-DNA
5、复制现象以来,先后有许多研究者在这一研究领域做了大量卓有成效的工作。然而,有效的反义RNA序列的设计仍然依赖于对病毒基因组结构与调控序列的研究进展。因此,必须选择那些对病毒生存和复制至关重要的基因部位进行反义抑制,而把作用于不同位点的多个反义RNA同时使用或串联或杂合反义核酸,达到阻止多个有害基因的表达,从而更好地发挥其抑制HBV的作用,这是值得研究的一个方向。 根据HBV基因组表达、复制特点,设计出针对S、C、P、X、前C(preC)、前S1(preS1)和前S2(preS2)基因的反义RNA
6、,特别是针对那些调节序列,如DR1、DR2、U5、增强子、启动子、帽子结构和poly(A)尾等,有可能获得更为有效的抑制作用。Korba等[3]评价了56条不同的针对HBV特定功能区的ASODN抑制HBV复制、表达的能力,结果表明,针对S基因与前S1基因区的ASODN可抑制细胞释放HBsAg及病毒颗粒,但不影响胞内HBV复制;针对S基因起始区的ASODN抑制HBsAg的产生最为有效;针对C基因区的ASODN抑制病毒颗粒产生,降低细胞内HBcAg的水平及HBV-DNA复制中间体的产量;针对多聚酶编码
7、基因区的ASODN不影响HBV复制水平,但可降低细胞释放HBeAg的水平;针对HBVε元件的上茎及环区的ASODN是HBV复制的最有效抑制剂。同时,还发现56条ASODN无一条影响HBV特异性RNA转录的水平,证明这些ASODN的作用机制是通过抑制mRNA翻译而实现的,因此,认为针对特定功能基因区关键位点的ASODN能阻断相应的功能蛋白的产生。ε元件的上茎及环区的结构是影响ε元件功能的关键因素,因此封闭该区就能有效抑制HBV的包装,从而抑制HBV的复制。 HBVX基因的表达产物X蛋白有反式激活功
8、能,它可以反式激活多种细胞及病毒启动子,激活HLA-1抗原启动子和多种细胞原癌基因启动子。HBVX蛋白与肝癌的发生密切相关,因此,抑制X蛋白的产生对预防HBV慢性感染后肝癌的发生具有重要的临床价值。刘素侠等[4]针对HBVX基因3个位点:翻译起始区、DR2、ENⅡ,设计合成了3条ASODN,其在HepG2.2.15细胞中观察其抗病毒活性与作用特性。结果发现,ASODN对HBV的抑制作用有“双峰现象”,即抑制效果达到最佳后下降到一定程度又回升,这可能跟一次性用药有关。Ma等[5]针对
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