慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展论文

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1、慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展论文【关键词】肝炎乙型慢性基因疗法治疗基因DNA反义RNA反义慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）感染引起的、病死率较高的一种慢性传染性疾病，易发展为肝硬化、肝癌。据资料显示［1，2］，全球约有3.5亿慢性乙肝患者，我国是慢性乙肝高发区，约有1.3亿患者。目前，基因治疗作为一种全新的治疗理念越来越受到人们的关注。基因治疗是指将外源性的有特定功能的目的基因（DNA或RNA片段）.freelRNA特异性结合，形成部分双链核酸，定点封闭靶基因，阻断特定基因表

2、达的一小段（20～30bp左右）人工合成的RNA分子，具有精确选择性和高度特异性，而且能显著抑制病毒复制，被认为是一种较理想的基因治疗药物。反义RNA可能通过以下几种反义作用机制达到抗HBV的目的：①反义RNA互补于特定的mRNA的非编码区，影响核糖体的结合，从而抑制翻译；②反义RNA互补于特定的mRNA的编码区，抑制翻译；③反义RNA通过激活RNaseH，使mRNA易于被核酸酶降解；④反义RNA作用于靶mRNA的5'端，阻止帽子结构的形成，影响靶mRNA的成熟；⑤反义RNA作用于3'端的poly(A)尾的形成，阻止

3、靶mRNA的成熟及其向胞浆内的转移；⑥反义RNA作用于外显子与内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接。通过以上几种机制，反义RNA可以在翻译水平阻断HBV的mRNA的表达。1.2依不同基因位点而设的ASODN的抗HBV能力自20世纪90年代初Goodarizi首次报道了反义RNA能特异抑制HBV-DNA复制现象以来，先后有许多研究者在这一研究领域做了大量卓有成效的工作。然而，有效的反义RNA序列的设计仍然依赖于对病毒基因组结构与调控序列的研究进展。因此，必须选择那些对病毒生存和复制至关重要的基因部位进行反义抑制，而把

4、作用于不同位点的多个反义RNA同时使用或串联或杂合反义核酸，达到阻止多个有害基因的表达，从而更好地发挥其抑制HBV的作用，这是值得研究的一个方向。根据HBV基因组表达、复制特点，设计出针对S、C、P、X、前C(preC)、前S1(preS1)和前S2(preS2)基因的反义RNA，特别是针对那些调节序列，如DR1、DR2、U5、增强子、启动子、帽子结构和poly(A)尾等，有可能获得更为有效的抑制作用。Korba等［3］评价了56条不同的针对HBV特定功能区的ASODN抑制HBV复制、表达的能力，结果表明，针对S基因

5、与前S1基因区的ASODN可抑制细胞释放HBsAg及病毒颗粒，但不影响胞内HBV复制；针对S基因起始区的ASODN抑制HBsAg的产生最为有效；针对C基因区的ASODN抑制病毒颗粒产生，降低细胞内HBcAg的水平及HBV-DNA复制中间体的产量；针对多聚酶编码基因区的ASODN不影响HBV复制水平，但可降低细胞释放HBeAg的水平；针对HBVε元件的上茎及环区的ASODN是HBV复制的最有效抑制剂。同时，还发现56条ASODN无一条影响HBV特异性RNA转录的水平，证明这些ASODN的作用机制是通过抑制mRNA翻译而

6、实现的，因此，认为针对特定功能基因区关键位点的ASODN能阻断相应的功能蛋白的产生。ε元件的上茎及环区的结构是影响ε元件功能的关键因素，因此封闭该区就能有效抑制HBV的包装，从而抑制HBV的复制。HBVX基因的表达产物X蛋白有反式激活功能，它可以反式激活多种细胞及病毒启动子，激活HLA-1抗原启动子和多种细胞原癌基因启动子。HBVX蛋白与肝癌的发生密切相关，因此，抑制X蛋白的产生对预防HBV慢性感染后肝癌的发生具有重要的临床价值。刘素侠等［4］针对HBVX基因3个位点：翻译起始区、DR2、ENⅡ，设计合成了3条ASO

7、DN，其在HepG2.2.15细胞中观察其抗病毒活性与作用特性。结果发现，ASODN对HBV的抑制作用有“双峰现象”，即抑制效果达到最佳后下降到一定程度又回升，这可能跟一次性用药有关。Ma等［5］针对HBVX基因设计了反义RNA，应用逆转录病毒转染HepG2.2.15细胞系，其HBsAg及HBeAg抗原表达分别下降37.9%和36.8%，HBV-DNA降低25%。1.3ASODN技术存在的问题尽管ASODN抗病毒的作用为人们治疗HBV感染展示了广阔的前景，但是仍然存在着一些问题：①ASODN主要通过封闭HBV的mRN

8、A来抑制HBV的复制与表达，而HBV的复制模板DNA仍然存在，因此，一旦停止治疗，HBV仍可能重新复制，显然研究如何封闭超螺旋HBV-DNA是一个值得考虑的方向；②ASODN在体内及细胞内的稳定性有待提高；③ASODN及其代谢物的安全性、副作用，尤其是长期毒性目前也知之甚少，这些都需要做更进一步的研究。2反义DNA技术由于反义RNA技术对源源不