age及葡萄糖对thp1巨噬细胞cxcl16mrna表达的影响

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1、AGE及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16mRNA表达的影响【摘要】目的：探讨晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGE)及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16mRNA表达的影响.方法：①选择合适的培养时间；②不同浓度的AGE与THP1巨噬细胞共同孵育；③不同浓度葡萄糖与THP1巨噬细胞共同孵育；分别用AGE、葡萄糖及同时加入AGE和葡萄糖与THP1巨噬细胞孵育；⑤采用RTPCR检测孵育后CXCL16及CD36mRNA的表达量，观察和比较各组孵育后CXCL16及CD36mRNA的表达情况.

2、结果：①随着培养液中AGE浓度的增加CXCL16及CD36mRNA的表达增加；②随培养液中葡萄糖浓度的增加CXCL16及CD36mRNA的表达增加；③AGE及葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞时,对CXCL16及CD36mRNA的表达上调作用大于AGE或葡萄糖单一因素的影响.结论：AGE及葡萄糖呈时间和浓度依赖性上调THP1巨噬细胞CXCL16mRNA的表达,并且AGE及葡萄糖两者合用可以进一步增加这种表达.这可能为糖尿病动脉粥样硬化机制的探讨提供新的线索.【关键词】CXCL16；糖基化终产物，高级；葡萄糖；糖尿病0引言结合磷脂酰丝氨酸和氧化

3、低密度脂蛋白（oxidizedloa公司；葡萄糖购自北京泛基诺科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取试剂为Gibco公司产品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA合成酶（MMLV）及Taq酶购自北京天为时代公司；其他试剂均为进口或国产分析纯.1.2方法1.2.1THP1细胞株培养人单核细胞系THP1株购于中科院上海细胞生物所细胞中心.THP1细胞生长于含有低糖（5.6mmol/L），100mL/L胎牛血清，10mmol/LHEPES，1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养基中，置于37℃，50mL/LC

4、O2饱和湿度培养箱内培养.1.2.2实验分组取对数生长期THP1细胞（1×106个/皿）进行实验，每次实验前用100nmol/LPMA孵育THP1细胞48h，使其诱导分化为巨噬细胞［6］.①单独AGE处理组：首先确定合适的培养时间，即用100mg/LAGE与THP1巨噬细胞孵育不同时间（0，6，12，24，48，72h），根据培养结果，选择72h为合适孵育时间，不同浓度的AGE（0，50，100，150mg/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72h；②单独葡萄糖处理组：用高浓度葡萄糖培养液（30mmol/L）与THP1巨噬细胞孵育不同时间

5、（0，6，12，24，48，72，96h），确定72h为合适培养时间后，用不同浓度葡萄糖（5.6，10，20，30mmol/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72h；③AGE和葡萄糖联合作用组：分别用AGE(100mg/L)、高浓度葡萄糖（20mmol/L）及同时加入AGE(100mg/L)和葡萄糖（20mmol/L）与THP1巨噬细胞孵育72h.1.2.3逆转录聚合酶链反应检测CXCL16及CD36mRNA的表达TRIzol试剂提取细胞总RNA，cDNA反应总体系为20μL：10mmol/LdNTP0.5μL，0.1mol/LDTT1μL，

6、500mg/LRandomprimer0.25μL，6.7×108nkat/LRNasin0.5μL，3.3×107nkat/LMMLV1μL，5×缓冲液2.0μL.以cDNA为模板，分别使用下述3对引物进行PCR，扩增CXCL16基因的引物序列为：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC3′，扩增片段长度为693bp.扩增CD36基因的引物序列为：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA3′，扩增片段

7、长度为246bp.扩增内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的引物序列为：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT3′,下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′,扩增片段长度为936bp.PCR反应条件为：95℃5min预变性，95℃30s变性，60℃30s退火，72℃30s延伸，30个循环，72℃继续延伸10min.PCR反应总体系为20μL：无RNA酶水14.75μL，10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP0.5μL，100g/L引物各1μL，8.3×107nkat/LTaq酶0.25μL，cDN

8、A模板1μL.1.2.4RTPCR产物检测及半定量分析反应结束后，取5μLPCR产物用10g/L的琼脂糖凝胶恒压80V电泳30min,溴化乙锭染色.