mk2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

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1、MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究：魏洁龚小卫明小燕王旭王达安邓鹏姜勇【摘要】目的：为了研究MAPK激活蛋白激酶2(MAPK-activatedproteinkinase2,MK2)细胞内定位与其功能的关系，构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法：将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(K2(320A)和活性突变体MK2(320E)，转染NIH3T3细胞，并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况。结果：各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后，在NIH3T3细胞中得到高

2、量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明，在静息状态下，MK2(K2(320E)主要分布于细胞质内，而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到紫外线（UV）刺激后，MK2(K2(320A)移位出核，而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变。结论：成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达，观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响。【关键词】蛋白激酶类；突变；基因表达；细胞内定位；p38丝裂原活化蛋白激酶；MAPK激活蛋白激酶2［Abstract］Objective:Tostudytheintrac

3、ellularlocalizationofMAPK-activatedproteinkinase2(MAPKAPK2/MK2)anditsrelationutantsutatedtoproducedominantnegativemutantMK2(320A)andconstitutivelyactivemutantMK2(320E).Thenthemutantsutantsicroscope.Results:Afteridentificationbysequencing,theGFP-fusedMK2mutantsainlyinthenuc

4、lei,andMK2(320E)ainlyinthecytosol,ulatedbyUV,MK2(K2fusedefunctionalpointmutationshaveeffectsontheintracellularlocalizationsofMK2.［Keyutation;geneexpression;intracellularlocalization;p38mitogenactivatedproteinkinase;MAPK-activatedproteinkinase2p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated

5、proteinkinase,MAPK）通路参与细胞生长、发育、分裂及细胞间功能同步等多种细胞生理过程的调控。在紫外线（ultraviolet,UV）照射、高渗、细菌脂多糖（lipopolysacharides,LPS）及炎性因子等作用下，p38MAPK被磷酸化激活［1］。活化的p38可通过磷酸化许多不同的底物，来介导诸如炎症因子的产生和细胞骨架重调等多种细胞反应［2］。MAPK激活蛋白激酶2（MAPK-activatedproteinkinase2,MAPKAPK2orMK2）作为p38的重要底物，具有多种细胞功能，例如稳定富含AU元件的m

6、RNA、调节肌动蛋白重建、调控细胞周期、参与细胞迁移等［3,4］。MK2被p38磷酸化激活后移位至胞浆，通过磷酸化小分子量热休克蛋白（smallheatshockprotein,sHSP）HSP27，来介导细胞骨架重调［5］。但目前对MK2的细胞内定位与其功能的关系还存在疑问。为了进一步阐明MK2细胞内定位与功能之间的关系，构建了绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP）标记的MK2不同突变体的融合表达载体，在哺乳动物细胞中进行表达并观察这些突变体在细胞内的定位情况。1材料和方法1.1质粒、菌株和试剂绿色荧光蛋

7、白标记的小鼠MK2融合表达载体GFP-MK2由美国Scripps研究所韩家淮教授馈赠。将该质粒转化大肠杆菌株DH5α，提取质粒DNA，用DNA定量仪测定浓度后置-20℃保存。大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由本室保存。DNAladder和MutanBEST定点突变试剂盒购自TaKaRa公司；引物合成和测序分析由Invitrogen公司完成。Petri小皿和细胞培养皿购自Corning公司。DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清（FBS）是GibcoBRL公司产品。4,6-联脒-2-苯基吲哚（4′,6-Diamidino-

8、2-phenylindole,DAPI）购自Sigma-Aldrich公司。PolyFect脂质体转染试剂和质粒小量制备试剂盒购自QIAGEN公司。1.2细胞培养NIH3T3细胞